張建明，鄧艷琴，王靈嵐，林代華，楊秀惠，嚴延生

狂犬病是一種危害嚴重的自然疫源性疾病，廣泛流行于世界各地，全球每年約有55 000人死于狂犬病，尤其在大量家犬任意放養(yǎng)的亞非等發(fā)展中國家，狂犬病發(fā)病率居高不下[1]。Pasteur于1885年首次分離出狂犬病毒(rabies virus，RV)[2-3]。1988年Tordo等[4-5]首次完成了狂犬病毒PV株的全基因序列測定。隨后的研究中證實，不同地區(qū)不同宿主動物的街毒株之間存在不同的基因亞型[6-7]。因此，分離各地自然界中流行的狂犬病毒街毒株，為研究遺傳變異規(guī)律積累理論資料意義重大。2000-2007年福建省狂犬病疫情呈現(xiàn)快速上升趨勢，2008年以來，在開展科學調(diào)查的基礎上實施加強基層技術人員的專項培訓、規(guī)范狂犬病暴露預防處置門診的建設、加強宣傳教育、強化家犬免疫、消滅傳染源等一系列綜合防治措施后，狂犬病發(fā)病率逐年下降[8]。但福建省狂犬病相關的實驗室基礎研究仍較薄弱，未見狂犬病街毒株分離的報道。本研究從福建省一傷人的可疑狂犬中分離出狂犬病毒街毒株，證實福建省家犬中存在狂犬病毒的流行，為防治工作提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1標本來源 收集來自福建省內(nèi)主動攻擊人的疑似狂犬的腦組織標本，無菌采集病犬腦組織作為病毒分離材料，置-70 ℃保存。

1.2細胞株和單抗 BHK-21細胞株由福建省疾病預防控制中心保存?？箍袢《締慰寺晒饪贵w由中國疾病預防控制中心病毒所惠贈。

1.3實驗動物 健康昆明系普通級乳鼠(1～2 d齡)，普通級小鼠(10 g左右)由福建省疾病預防控制中心實驗動物中心提供。

1.4犬腦組織標本的處理 無菌取出發(fā)病犬腦組織，一部分腦組織冷凍保存，一部分腦組織加入到玻璃研磨器中研磨，用含有雙抗(青霉素1 000 u/mL，鏈霉素1 000 μg/mL)的PBS制成30%懸液(w / v)，4 ℃靜置2 h后，4 ℃離心(3 000 r/min)20 min，取上清，移入滅菌試管中，-70 ℃保存作為接種材料。

1.5病毒分離法 采用乳鼠腦接種(Mouse InoculationTest，MIT)和細胞培養(yǎng)(Cell-culture Isolation Techniques，CIT)分離狂犬病毒，具體操作參照文獻[9]。

1.6RT -PCR檢測病毒核酸 參考《全國狂犬病監(jiān)測方案》[10]中狂犬病實驗室檢測技術指南中提供的引物，由TaKaRa公司合成引物N1(5′-TTTGAGACTGCTCCTTTT-3′)、N2(5′-CCCATATAGCATCCTAC-3′)，操作參照TaKaRa 公司one step RT-PCR試劑盒說明書進行。

1.7病毒生物學特性研究 病毒感染力的滴定(TCID50的測定)及LD50的測定，參考文獻[9-11]進行。

2 結(jié) 果

2.1直接免疫熒光法(FAT)檢測腦組織 采集獲取可疑狂犬的腦組織，制作印片，冷丙酮固定，染色后鏡檢。在熒光顯微鏡下我們首先找到細胞，在細胞漿內(nèi)可以看到被染成鮮亮的蘋果綠色或黃綠色的特異性熒光染色杜，有圓形、橢圓形、點狀等多種形態(tài)，大小不一，有實體感。腦組織各部位的熒光量相當，沒有顯著差異(圖1B)。

2.2MIT法分離病毒 乳鼠在接種犬腦組織懸液后，第11 d開始發(fā)病，表現(xiàn)出典型的狂犬病臨床癥狀，哺乳能力減弱，發(fā)病初期，肌肉震顫，步樣失調(diào)，之后，表現(xiàn)后肢運動障礙，行走時抱腿，最后全身麻痹而死亡，第13 d所有接種發(fā)病犬腦組織懸液的乳鼠均死亡。對照乳鼠無明顯發(fā)病癥狀或死亡。小鼠的腦組織作FAT檢測，視野內(nèi)可見大量高密度綠色熒光顆粒和沙粒樣熒光物(圖1D)。將發(fā)病小鼠的腦組織懸液接種新一批乳鼠后，第8 d乳鼠出現(xiàn)典型的狂犬病癥狀，并開始死亡。

2.3CIT法分離病毒 犬腦組織懸液上清接種

圖1犬和鼠腦組織FAT檢測結(jié)果(×100)

Fig.1FATtestresultsofdogandratbraintissues

A: Normal dog brain tissues; B: Rabid dog brain tissues; C: Normal rat brain tissues; D: Rabid rat brain tissues.

BHK-21細胞，連續(xù)傳代4代(每代4 d)，每次傳代前均收集部分細胞進行FAT檢測，檢測結(jié)果如圖2所示，由圖可看出從病毒接種后8～16 d均可在BHK-21細胞胞漿內(nèi)看到由狂犬病毒所產(chǎn)生的特異性包涵體熒光灶，隨著傳代次數(shù)的增加，被感染細胞比例逐漸提高，綠色熒光也逐漸增強。

圖2病毒在BHK-21細胞中的FAT檢測結(jié)果與增殖(×400)

Fig.2ResultsofrabiesvirusinBHK-21byFAT(×400)

A: Negative; B: Virus inoculation 8 days; C: Virus inoculation 12 days; D: Virus inoculation 16 days.

2.4RT-PCR法鑒定狂犬病毒 以犬腦組織標本提取的病毒RNA為模板，以N1、N2為引物，用RT-PCR法常規(guī)擴增核蛋白(N)基因的保守區(qū)域目的基因，經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測均可得到特異的與預期片段大小(443 bp)一致的基因片段，結(jié)果見圖3。核酸擴增的序列(參見GenBank登陸號：FJ866835)與GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的狂犬病毒株序列比對，與多數(shù)毒株的核苷酸同源性大于80%，證實是狂犬病毒。

圖3病毒RT-PCR擴增結(jié)果

Fig.3ResultsofRT-PCR

M: DNA Marker (DL2000); 1: PCR product (443 bp); 2: Negative.

2.5BHK-21細胞病毒液的TCID50測定結(jié)果 本研究分離的街毒在BHK-21細胞連續(xù)傳代，取第四代進行病毒液感染力的測定，熒光檢測結(jié)果見表1。根據(jù)K?rber公式計算：Log TCID50=-1-1×(4.375-0.5) =-4.875，得TCID50為104.875/100 μL。

表1 病毒TCID50測定結(jié)果

2.6病毒腦組織懸液LD50測定結(jié)果 取第2代發(fā)病死亡的乳鼠腦組織，研磨制成懸液，按10倍倍比稀釋，接種10 g左右的小鼠，小鼠死亡情況見表2。根據(jù)K?rber公式計算：Log LD50=-1-1×(4.85-0.5) =﹣5.35，得Log LD50= 105.35即每0.03 mL的30%腦組織病毒懸液中含有105.35個Log LD50。

3 討 論

狂犬病在臨床上常因個體差異而表現(xiàn)各異，需要進行病原的檢測和實驗室診斷。FAT方法[11]是狂犬病抗原實驗室診斷最常用、最精確、快速和最可靠的方法。MIT法[12]是最早應用于狂犬病毒檢測與分離的一種經(jīng)典方法，本方法的特點是敏感，準確性較高，試驗要求不高，適于不具備組織培養(yǎng)條件的實驗室分離狂犬病毒街毒；但是周期長，僅憑動物發(fā)病癥狀不足以確診，常常需要配合免疫熒光法作特異性鑒定。CIT法的特點是敏感，周期短，成本低，需在具備組織培養(yǎng)條件的實驗室中進行，適合樣本量較大時的檢測；但同樣也需配合免疫熒光進行特異性診斷，樣品嚴重污染細菌或腐敗致使樣品中病毒失活，會導致分離病毒失敗。RT-PCR法的特點是敏感、特異、結(jié)果可靠，節(jié)省時間，在3 h內(nèi)便可以得出結(jié)果，適合用于臨床確診。RT-PCR法也可以檢測腐敗組織里的狂犬病毒。但是，RT-PCR對內(nèi)外環(huán)境要求嚴格，外部環(huán)境要求潔凈的空氣、一次性用品，內(nèi)部環(huán)境要求PCR儀器內(nèi)反應溫度均一，同時，要想擴增成功取樣必須準確。

表2 乳鼠腦接種病毒分離試驗結(jié)果

理論上雞胚纖維母細胞、地鼠腎細胞及BHK-21、Vero等傳代細胞均可用于狂犬病毒的分離培養(yǎng)[9]，但不同的狂犬病毒街毒株在細胞培養(yǎng)中的分離和生長特性等生物學特性不同。本研究采用BHK-21細胞進行病毒分離，TCID50測定結(jié)果顯示細胞毒滴度水平較低，所分離的街毒株對細胞的適應性有待加強，在接毒量少、培養(yǎng)時間短的情況下，病毒不能完全適應細胞并在細胞中繁殖。

本研究從狂犬的腦組織標本接種細胞培養(yǎng)物中分離出狂犬病毒樣病毒，綜合MIT、FAT、RT-PCR與核酸測序結(jié)果，表明分離的病毒為狂犬病毒。從福建省家犬中成功分離到狂犬病毒，證實福建省家犬中存在狂犬病毒的流行，也為福建省狂犬病毒的分子生物學研究及狂犬病的防制奠定基礎。

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