鄭 斌，尹志奎，姚志軍，張海珠，任紅斌，詹希美

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii,Tg)為人獸共患弓形蟲病(Toxoplasmosis)的病原體。蟲體感染宿主時(shí)，主動(dòng)入侵宿主細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)發(fā)育、增殖[1]。微線體蛋白(microneme protein, MIC)是由弓形蟲頂端胞器微線體分泌的一類蛋白，在蟲體入侵細(xì)胞時(shí)發(fā)揮重要功能[2]。研究發(fā)現(xiàn)部分敲除MIC2后，蟲體的粘附和入侵能力下降了78%[3]。MIC2為Ⅰ型跨膜蛋白，位于胞外的氨基端(N端)識(shí)別、粘附宿主細(xì)胞；位于胞內(nèi)的羧基端(C端)和醛縮酶相互作用，由醛縮酶介導(dǎo)與蟲體的肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白動(dòng)力系統(tǒng)偶聯(lián)[4]。本研究對(duì)弓形蟲MIC2與醛縮酶的作用位點(diǎn)進(jìn)行了探討，旨在為揭示MIC2的生物學(xué)功能和弓形蟲的入侵機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1弓形蟲蟲株、質(zhì)粒和主要儀器 弓形蟲強(qiáng)毒株(RH株)和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)研究室傳代保種。蛋白電泳及電轉(zhuǎn)移裝置(Mini-PROTEIN 3 Cell)為Bio-Rad公司產(chǎn)品；核酸蛋白質(zhì)分析儀(BeckmanDU640)為Beckman公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑EcoRI 和SmaI 限制性內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品；GST pull-down用sepharose(Glutathione sepharoseTM4B)、GST融合蛋白親和純化柱(GSTrap FF)購自Amersham Biosciences公司；硝酸纖維素膜(NC)為PALL公司產(chǎn)品；免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECM)試劑盒(兔IgG)購自Promege公司；X感光膠片為Kodak產(chǎn)品；顯影液和定影液購自武漢博士德公司；GST-MIC2C蛋白和抗醛縮酶多克隆抗體(anti-aldolase)為本研究室前期制備[5-6]。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1MIC2C W/A/pGEX-4T-1重組原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 根據(jù)報(bào)道的弓形蟲RH株MIC2的基因序列(U62660)[7]，將MIC2 C端767位色氨酸(W)突變?yōu)楸彼?A)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物并合成(上游引物：5’-GAACCCGGGAGTTACCACTACTATTTGAGCTC-3’，下游引物：5’-GGGGAAT

TCCTACTCCATCGCCATATCACTATCGTC-3’，其中CCCGGG為SmaI 酶切位點(diǎn)，GAATTC為EcoRI 酶切位點(diǎn))。按照文獻(xiàn)[8]的方法完成MIC2C W/A基因片段的PCR擴(kuò)增及MIC2C W/A/pGEX-4T-1重組原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。

1.2.2GST-MIC2C W/A突變體融合蛋白的制備 GST-MIC2C W/A突變體融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及蛋白濃度分析具體操作見文獻(xiàn)[8]。

1.2.3GST pull-down實(shí)驗(yàn)鑒定蛋白作用位點(diǎn) 制備新鮮弓形蟲速殖子裂解液，分別以GST-MIC2CW/A突變體蛋白和GST-MIC2C蛋白(陽性對(duì)照)作為探針蛋白與弓形蟲速殖子裂解液進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)，具體操作見文獻(xiàn)[9]，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物常規(guī)處理，SDS-PAGE及Western blot分析。

2 結(jié) 果

2.1弓形蟲MIC2C W/A突變體基因片段的PCR擴(kuò)增 以弓形蟲cDNA第1鏈為模板，PCR擴(kuò)增MIC2CW/A基因片段，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示在100～200 bp之間有一條帶，與目的基因片段大小相符(圖1)。

圖1MIC2CW/A基因片段PCR產(chǎn)物

Fig.1PCRproductsofMIC2CW/Agenefragment

M: 100 bp DNA ladder；1-2: PCR products of MIC2C W/A gene fragment.

2.2GST-MIC2C W/A融合蛋白的表達(dá) 37 ℃，IPTG 1 mmol/L的條件下誘導(dǎo)表達(dá)GST-MIC2C W/A融合蛋白，SDS-PAGE分析(圖2)。結(jié)果顯示在誘導(dǎo)1～7 h均有目的蛋白表達(dá)(箭頭示)。大量搖菌，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，GSTrap FF純化融合蛋白，核酸蛋白分析儀分析GST-MIC2C W/A突變體蛋白的濃度為2.55 mg/ml。

圖2GST-MIC2CW/A融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

Fig.2OptimumconditionfortheexpressionofGST-MIC2CW/Afusionprotein

M: Protein molecular weight marker; 1-4: MIC2C W/A/pGEX-4T-1/BL21 induced by IPTG 7, 5, 3, and 1 h respectively; 5: MIC2CW/A/pGEX-4T-1/BL21 uninduced; 6: pGEX-4T-1/BL21 induced by IPTG 7 h; 7: BL21 induced by IPTG 7 h.

2.3GST pull-down產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western blot分析 以GST-MIC2C W/A蛋白為探針蛋白，與弓形蟲速殖子裂解液進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物常規(guī)處理。以GST-MIC2C蛋白與弓形蟲速殖子裂解液進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)物為對(duì)照，共同進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析(圖3)。結(jié)果表明GST-MIC2C蛋白的pull-down產(chǎn)物中可見一蛋白條帶，可被醛縮酶抗體(anti-aldolase)識(shí)別，而GST-MIC2C W/A蛋白的pull-down產(chǎn)物中則未見蛋白條帶。

圖3GSTpull-down產(chǎn)物的SDS-PAGE和Westernblot分析

Fig.3SDS-PAGEandWesternblotanalysisofproductsfromGSTpull-downexperiment

M: Protein molecular weight marker; 1:T.gondiilysate; 2: The products of GST-MIC2C protein pull-down; 3: GST-MIC2C protein; 4: The products of GST-MIC2C W/A protein pull-down; 5: GST-MIC2C W/A protein.

3 討 論

伯氏瘧原蟲的血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)未知蛋白(Thrombospondin-related anonymous proteins, TRAP)和環(huán)子孢子蛋白TRAP相關(guān)蛋白(CS protein-TRAP-ralated protein, CTRP)C端的色氨酸(W)對(duì)應(yīng)密碼子的堿基突變后，瘧原蟲的子孢子和動(dòng)合子則不能運(yùn)動(dòng)，而且失去入侵宿主細(xì)胞的能力[10-12]。Clustalw對(duì)比分析瘧原蟲TRAP、CTRP和弓形蟲MIC2的C端序列，結(jié)果提示蛋白C端的色氨酸(W)為保守氨基酸(圖4)，由此推測(cè)弓形蟲MIC2 C端的W可能為其關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。

圖4弓形蟲MIC2、惡性瘧原蟲CTRP和TRAP蛋白序列的對(duì)比分析

Fig.4ProteinsequencealignmentofTgMIC2,PfCTRPandPfTRAP

體外定點(diǎn)突變技術(shù)是研究基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能的重要技術(shù)[13-14]。利用該技術(shù)，弓形蟲致密顆粒蛋白(dense granule proteins，GRAs)在蛋白切割中的作用及抑制蛋白(profilin)β-hairpin的功能得以揭示[15-16]。常用的定點(diǎn)突變方法有盒式突變、寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變及PCR 介導(dǎo)的定點(diǎn)突變等。定點(diǎn)突變技術(shù)多用于單個(gè)或幾個(gè)核苷酸的變異，若需要變異多個(gè)核苷酸或?qū)蚪M進(jìn)行編輯、修飾等，則采用鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)等技術(shù)[17]。已經(jīng)運(yùn)用TALENs對(duì)線蟲的基因組進(jìn)行了定點(diǎn)編輯，弓形蟲基因組的編輯、修飾還未見報(bào)道[18]。本研究采用核苷酸引物介導(dǎo)的突變方法將MIC2的W突變?yōu)锳。用制備的GST-MIC2C W/A突變體蛋白作為探針蛋白與弓形蟲裂解液進(jìn)行GST pull-down實(shí)驗(yàn)，GST-MIC2C蛋白為對(duì)照，結(jié)果顯示GST-MIC2C W/A突變體蛋白不能沉降弓形蟲裂解液中的醛縮酶蛋白，即當(dāng)W變?yōu)锳時(shí)，MIC2C與醛縮酶之間的相互作用消失，從而證明W為兩蛋白的相互作用位點(diǎn)。

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