陳經(jīng)雕,楊杏芬,柯昌文,梁文佳,柯碧霞,劉美真,譚海玲,李柏生,張萬里

布魯氏菌(Brucella)是一種革蘭陰性、兼性厭氧的細胞內(nèi)寄生菌，可引起嚴重危害人民健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人獸共患傳染病-布魯氏菌病(Brucellosis)(簡稱布病)的廣泛流行。目前世界上 170 多個國家和地區(qū)有此病的存在和流行,已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。我國自1905年首次報告該病以來,幾乎每個省(市、區(qū))的人、畜中都有不同程度的存在和流行。目前,對布魯氏菌的分子分型方法有聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RELP)[1]、AMOS-PCR[2]及其衍生技術、單核苷酸多態(tài)性研究(SNP)[3]、脈沖場凝膠電泳圖譜分型[4](PFGE)、多位點序列分型[5](MLST)和多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分型[6](MLVA)等基因分型技術,但這些分型方法對布魯氏菌的分型能力的適用性、優(yōu)越性方面，尚少見系統(tǒng)的評價研究。本研究通過對廣東地區(qū)不同年代、地域的、不同種型的60株布魯氏菌地方株和3株標準株(16M、544A、1330S)應用PFGE 和 MLVA兩種技術進行了分子分型研究，并對兩種技術在布魯氏菌的分型能力和潛在價值進行比較和評價，現(xiàn)將情況報告如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 1965-2010年廣東地區(qū)各級農(nóng)業(yè)獸醫(yī)機構的動物或衛(wèi)生醫(yī)療機構的布病病人分離株60株，其中上世紀60年代6株、80年代2株、其余52株為2005-2010年收集；地區(qū)分布為廣州35株、深圳14株、珠海4株、中山、佛山、東莞各2株、江門1株；標準菌株16M、544A、1330S由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所布病室惠贈。

1.2主要試劑和儀器 鑒定血清、噬菌體均由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所布病室提供；引物由上海生工公司合成，Premix反應體系(TaKaRa)、限制性內(nèi)切酶XhoI(Promega)、蛋白酶K(Merck公司)、Seaken Gold Aga-rose(Cam Brex)、Tris-EDTA和SDS，所有試劑均在有效期內(nèi)使用。PCR儀(Eppendorf)、脈沖場凝膠電泳儀(CHEF Mapper)、GEL 2000凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)和毛細管電泳儀(QIAxcel Advanced)。

1.3菌株的復核鑒定 收集全省各地農(nóng)業(yè)獸醫(yī)機構或醫(yī)療機構初步鑒定為布魯氏菌的動物或臨床病人菌株到省疾控中心作進一步的復核鑒定,并由當?shù)丶部刂行氖占∪伺R床及流行病學資料。根據(jù)菌落形態(tài)、染色、生長特性、診斷血清凝集試驗對上送菌株進行復核鑒定為布魯氏菌，再采用噬菌體裂解試驗、染料抑菌試驗(硫堇、堿性復紅)、H2S產(chǎn)生試驗、單項特異性血清凝集試驗進行種、型鑒定。具體方法依據(jù)《布魯氏菌病防治手冊》[7]進行操作。

1.4脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術 參照文獻[4]并進行優(yōu)化,主要的步驟有:取新鮮培養(yǎng)菌落,制成OD值4.8～5.2的菌懸液，包埋菌體細胞，用50U的XhoI限制性內(nèi)切酶進行酶切，0.5×TBE液2 300 mL、14 ℃、120°、6 V/cm條件下電泳,脈沖時間2～25 s，電泳時間19 h，用H9812作分子量標準對照。電泳結束后用EB染色30 min,三蒸水脫色3次，每次20 min，即可讀膠，用Bio Numerics(Version 5.0)軟件處理圖譜，選擇Dice相似性系數(shù)和非加權的幾何平均數(shù)(UPGMA)進行聚類分析。

1.5多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分型(MLVA)技術[8]16個位點的引物參照文獻[9-10]，見表1。其中panel 1包括bruce 06、08、 11、12、42、43、45和55共8個位點；panel 2A 包括bruce18、19和21共3個位點，panel 2B包括 bruce04、07、09、16和30共5個位點。挑取布氏斜面培養(yǎng)24～48 h的菌落,提取基因組DNA。采用25 μL反應體系,其中Premix 12.5 μL、上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL、模板1.0 μL、去離子水9.5 μL。反應條件：預變性96 ℃、3 min,變性96 ℃、30 s,退火60 ℃、30 s,延伸72 ℃、30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃、5 min。每次擴增均分別設陽性、陰性對照。panel 1位點采用瓊脂糖凝膠電泳確認PCR產(chǎn)物大小。panel 2位點采用毛細管電泳讀取PCR產(chǎn)物大小。根據(jù)各菌株各位點的PCR擴增產(chǎn)物的大小(bp),通過標準菌株1330S計算得出各位點的重復單元數(shù)。得出每株菌株的16位數(shù)字編碼(各數(shù)字相對應于各位點的重復單元數(shù)),即MLVA等位基因類型。使用Bio Numerics(Version 5.0)軟件處理圖譜，選擇 Dice 相似性系數(shù)和非加權的幾何平均數(shù)(UPGMA)進行聚類分析。

1.6分型能力的比較和分析 可用辛普森(Simpson′s diversity index，DI)指數(shù)作為 PFGE 和 MLVA 兩種分子分型方法的指標進行分型、分辨能力比較、評價、其公式[11]：

其中N表示菌株總數(shù) ,nj為某一型別的菌株數(shù)。

2 結 果

2.1菌株鑒定結果 60 株地方株經(jīng)單項特異性血清凝集試驗、噬菌體裂解試驗、染料抑菌試驗(硫堇、堿性復紅)和 H2S 產(chǎn)生試驗檢測,并將檢測結果與FAO/WHO 1985 年公布的布魯氏菌分類表[7]比較。所有菌株中，除了 1965 年的 6 株(4 株羊種、2 株豬種)菌株因變異不能分型外,其余菌株均能鑒定到型的水平，其中羊種 3 型 54 株、豬種3型3株、羊種1型3株。

2.2PFGE分型結果 菌株經(jīng)XhoI酶切后用Bio Numerics軟件分析，結果顯示:63株菌株間相似性系數(shù)介于72.1%～100%，在94.4%相似性系數(shù)時可將菌株分為10個克隆復合群17種PFGE型別，可區(qū)分羊、豬、牛3個種，但不能有效區(qū)分同種異型；在100.0%相似性系數(shù)時可將菌株分為14個克隆復合群共29種PFGE型別。其中15株(23.8%)為單態(tài)群,另外48株(76.2%)分屬于14種克隆復合群,各群分別含2～8 株菌。見圖 1。

圖1 63株布魯氏菌 PFGE 分型聚類圖

Fig.1ClustermapforPFGEtypein63strainsofBrucella

2.3MLVA 分型結果 經(jīng)Bio Numerics軟件分析聚類后,63 株菌株間相似性系數(shù)介于 16.9%～100%，在 52.3% 相似性系數(shù)時可將菌株分為 3 個克隆復合群 5 種 MLVA 型別，也可區(qū)分羊、豬、牛3個種的菌株，也不能有效區(qū)分同種異型；在 100.0% 相似性系數(shù)時可將菌株分為 8 個克隆復合群共 47 種 MLVA 型別,表現(xiàn)出較大的遺傳多樣性。其中 39 株(61.9%)為單態(tài)群,另外 24 株(38.1%)分屬于 8 個克隆復合群,各群分別含 2～5 株菌。結果見圖 2。

圖2 63株布魯氏菌MLVA分型聚類圖

Fig.2ClustermapforMLVAtypein63strainsofBrucella

2.4PFGE和MLVA分型方法的比較和相關性 用DI值作為分型系統(tǒng)分辨力的指標，PFGE分型在100.0%相似性系數(shù)時可將菌株分為14個克隆復合群和15個單態(tài)群，共29種型別，DI為0.957 5；MLVA分型在100.0%相似性系數(shù)時可將菌株分為8個克隆復合群和39個單態(tài)群，共47種型別，DI為0.985 2。結合菌株的背景資料分析，存在同一暴發(fā)事件(2010年珠海的4株菌株)的菌株有相同的MLVA型別和相近的PFGE型別；也存在部分菌株有相同的PFGE型別，卻分為不同MLVA型別或相同的MLVA型別，卻分為不同PFGE型別的情況；還存在相同或相近年份的同種菌株的PFGE和MLVA型別都有較高的同源性特點。

3 討 論

自1887年Bruce分離到羊種布魯氏菌以來，該菌的分種分型一直存在爭議。鑒于傳統(tǒng)的分型方法周期較長且操作繁瑣以及生物安全的風險,且近年來,國內(nèi)出現(xiàn)了10%～30%的非典型菌株使用傳統(tǒng)方法無法分型的情況[12]，這些菌株應用傳統(tǒng)的分型方法不能在分類表上找到合適的位置，說明傳統(tǒng)的分型方法存在一定的缺陷，更重要的是嚴重影響對布病疫區(qū)分類的判定，從而不能采取合理有效的預防控制措施。

表1 MLVA-16引物

隨著傳統(tǒng)分型方法在實際工作中的受限和分子生物學基因分型技術的迅速發(fā)展,從基因水平對布魯氏菌菌株進行研究的方法越來越多[1-6]?；蚪M研究顯示布魯氏菌屬的羊、豬、牛種等大多數(shù)種均來源于同一克隆，種間同源性極高，高頻率內(nèi)切酶在鑒定分型方面存在局限性；又因其DNA發(fā)生重排，如插入、丟失，導致酶切位點的移動，或酶切位點發(fā)生點突變，但發(fā)現(xiàn)各種間都有保守的獨特指紋譜帶[7]，因此有學者采用稀有位點內(nèi)切酶對染色體進行消化[13]。根據(jù)酶切片段電泳圖譜的不同，揭示基因組間差異，可以將布魯氏菌在種的水平上區(qū)別開，因而引入脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術作為傳統(tǒng)生物分型的補充手段，對布魯氏菌屬進行分子分型。PFGE是用稀有位點的限制性核酸內(nèi)切酶對細菌的染色體DNA進行消化酶切，得到較大的片段[14]，然后在交變脈沖電場的作用下進行電泳，可將大小各異的DNA片段分開。由于該法使用細菌的原位酶切可反映整個細菌的基因情況，而不是某個片段，因而可顯示基因組的微小變化，如酶切位點的突變、基因序列的插入或刪除造成的條帶的變大、變小或消失。因此，該方法可用于整個染色體基因組分析，對了解細菌的遺傳特征有著重要意義[15]。作為病原菌分子分型的“金標準”，已廣泛用于大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌和布魯氏菌等的分型研究[16]。Jensen等[17]應用PFGE方法對布魯氏菌DNA核酸限制內(nèi)切酶的圖譜進行了分析鑒定，證實RB51菌株與其他牛種布魯氏菌菌株不同。Ridler等[18]用限制性內(nèi)切酶SwaⅠ消化12株綿羊附睪種布魯氏菌后做脈沖場凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)綿羊附睪種存在變種。崔步云等[19]對布魯氏菌的19株標準菌株進行多次試驗分析，證明PFGE應用于布魯氏菌的可重復性和特異性較好。

研究也發(fā)現(xiàn)布魯氏菌屬的基因組存在大量重復序列，擴增細菌基因組中廣泛分布短重復序列間片段，在各型別中拷貝數(shù)有所不同，從而對布魯氏菌屬進行分型[11]。MLVA是一種基于PCR技術的基因分型方法,該法根據(jù)散在于菌株基因組中不同獨立位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(VNTR)的拷貝數(shù)多少來進行基因分型[20]。對研究病原菌的暴發(fā)感染和溯源起到重要作用，為確定菌株之間的親緣關系提供了可靠的技術手段[21]。因具有操作簡便、快速穩(wěn)定、分辨率高和可重復性強[8]等優(yōu)點,可廣泛用于一些具有遺傳同源性的病原菌如炭疽桿菌[22-23]、鼠疫耶爾森菌[24-25]、金黃色葡萄球菌[26]、結核菌屬[27-28]和布魯氏菌[8,29]的分型研究。該技術用于研究布魯氏菌的基因分型,不僅可以用于布病暴發(fā)流行的傳染源追溯和流行趨勢的分析，還可用于探索國內(nèi)外、同一地區(qū)的布病各菌株間的相關性、地理分布及傳播過程等分子流行病學的研究。Bricker等[30]對美國97份畜牧業(yè)分離菌株和實驗室6株牛種布魯氏菌進行分析，結果顯示分型的重復性很好，8個位點的等位基因多樣性和頻率都有很大差別；Le Fléche等[8]采用MLVA-15將來自不同地區(qū)的257株布魯氏菌分為204個基因型,結果表明該法的分析結果與表型鑒定結果一致，而且將某地區(qū)的分離菌株與世界各國不同階段的分離菌株進行遺傳進化分析，可示蹤布魯氏菌在某一地區(qū)的流行趨勢，查明該地區(qū)布魯氏菌流行株傳入途徑。

本次研究利用PFGE、MLVA技術分析了不同年份、地域的不同種型布魯氏菌的地方株和標準株，PFGE聚類分析可見：63株菌株間相似性系數(shù)介于72.1%～100%，在94.4%相似性系數(shù)時可將菌株分為10個克隆復合群17種PFGE型別；在100.0%相似性系數(shù)時可將菌株分為14個克隆復合群共29種PFGE型別。MLVA聚類分析可見：63株菌株間相似性系數(shù)介于16.9%～100%，在52.3%相似性系數(shù)時可將菌株分為3個克隆復合群5種MLVA型別；在100.0%相似性系數(shù)時可將菌株分為8個克隆復合群共47種MLVA型別,表現(xiàn)出較大的遺傳多樣性。兩種方法聚類顯示均可以在一定的相似系數(shù)從種的水平區(qū)分羊、豬、牛種的布魯氏菌，但在種的基礎上不能有效區(qū)分同種異型，該結論與駱利敏等的研究結果一致[4]。

本次研究的菌株病例個案流調(diào)資料顯示除了珠海的4株菌為同一暴發(fā)事件所收集外，其它菌株均來自散發(fā)病例，部分病例都有加工、食用過羊胎盤或從事羊、豬、牛養(yǎng)殖、屠宰及售賣等接觸史,但具體的羊、豬、牛來源調(diào)查由于涉及跨部門的協(xié)調(diào)問題局限了調(diào)查的深入進行,故未能深入追蹤,掌握羊、牛的具體來源。但兩種方法的聚類均提示多地的散發(fā)菌株呈現(xiàn)100%同源,提示這些菌株分別來自同一克隆,這可能由于來自同一疫區(qū)的染疫牲畜進入廣東后分散到各地市再感染人所致，從而表現(xiàn)為各地表面上的散發(fā)。

聚類分析還顯示：兩種方法中的1965年的羊種與近幾年(2005-2010年)的羊種同源性只有75.5%(PFGE)和37.3%(MLVA)，均存在較大變異，各自獨立成簇，表現(xiàn)出年度之間的差異，但因1965年的菌株發(fā)生變異不能確定其型別，但聚類看出1965年的羊種與近幾年的羊種菌株分別來自不同的克隆；而牛種菌544A標準株與1965年的羊種菌反而有較高的相似性：PFGE(94.4%)和MLVA(42.2%)，特別是PFGE方法顯示出非常接近的遺傳背景。

本研究選擇了羊、豬、牛3個種的不同型別的63株布魯氏菌菌株，結合菌株背景資料將PFGE(XhoI)與MLVA 基因分型方法同時進行分辨能力的比較。當辛普森指數(shù)DI值大于0.9即可認為該分型方法可信和具有較好的分辨能力[10]。結果顯示兩種分子分型方法都具有良好的分辨能力，但MLVA分辨力稍高于PFGE。PFGE 能把相同來源的菌株聚類成簇，MLVA把菌株從親緣關系上細分，MLVA方法在分析菌株的親緣進化關系方面具有一定的優(yōu)勢。PFGE、MLVA基因分型數(shù)據(jù)可在各實驗室之間傳輸，可得到更多關于致病性基因和親緣進化方面的研究資料，在建立全球數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)資源長期共享中具有較大的潛力。

致謝: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所布病室的全體專家對相關菌株的鑒定分析提供了幫助,謹致誠摯感謝。

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