馮安貴，高勇強(qiáng),梁 瑜，吳 媛，陳 鵠，張愉快，王可耕，陳姍姍，肖建華

日本血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人體健康的人獸共患病，目前尚無有效的疫苗控制疾病的傳播，研制有效的疫苗及尋找有效的疫苗候選分子成為血吸蟲病研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)[1-2]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及免疫學(xué)的發(fā)展, 血吸蟲病疫苗已由滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程重組蛋白疫苗發(fā)展到核酸疫苗[3-4]。核酸疫苗是快速發(fā)展起來的新型疫苗，包括DNA疫苗和cDNA疫苗，是由編碼抗原基因或基因片段插入質(zhì)粒載體中構(gòu)成重組質(zhì)粒，接種后能被機(jī)體組織細(xì)胞攝取和在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)的目的抗原分子能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，達(dá)到抗感染的目的[5]。日本血吸蟲在其寄生生活中，需要不斷地從宿主體內(nèi)攝取營(yíng)養(yǎng)以滿足其生長(zhǎng)、發(fā)育和生存的需要。我們前期在對(duì)日本血吸蟲基因組的研究中發(fā)現(xiàn)了一新基因—組織蛋白酶 B 肽鏈內(nèi)切酶B2(Schistosomajaponicumcathepsin B peptide enzyme 2，Sjcb2)，其基因登錄號(hào)為AY226984，研究顯示Sjcb2能降解宿主血紅蛋白，為血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育提供必需的營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)也是一個(gè)重要的致病因子[6-7]。為了進(jìn)一步研究Sjcb2能否作為疫苗候選抗原分子，我們通過構(gòu)建Sjcb2核酸疫苗，免疫動(dòng)物，檢測(cè)其抗血吸蟲感染作用，以便為日本血吸蟲疫苗研究提供新的候選分子。

1 材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料 pcDNA3.1(+)Sjcb2 質(zhì)粒由本研究所保存；噻唑藍(lán)(MTT)購于Sigma公司；RNA酶、DNA酶購于 Promega 公司；一抗：鼠抗日本血吸蟲免疫血清，本實(shí)驗(yàn)室制備，二抗：生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 購于北京中山生物公司；BALB /c小鼠由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供；含尾蚴的陽性釘螺購自湖南省岳陽市血吸蟲病防治研究所。

1．2方法

1．2．1pcDNA3.1(+) /Sjcb2核酸疫苗的免疫接種 105只雌性BALB /c小鼠隨機(jī)分為3組，每組20只，即DNA疫苗組(pcDNA3.1/Sjcb2)、pcDNA3.1組和生理鹽水組；將提取的pcDNA3.1(+) /Sjcb2重組質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒DNA分別用滅菌雙蒸水稀釋至1 μg/μL。 pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒組與pcDNA3.1質(zhì)粒組每只小鼠股四頭肌接種質(zhì)粒DNA 100 μg /次，生理鹽水組接種生理鹽水100 μL /次，每2周免疫1次，共免疫3次。

1．2．2PCR法檢測(cè)Sjcb2基因在小鼠肌細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性 第1次免疫后1、3、7、10、14及第2次免疫后14 d，第3次免疫后14 d和28 d，每組取小鼠 3只，麻醉后斷頸法處死小鼠，取腿部肌肉提取總DNA，使用Sjcb2特異性引物，擴(kuò)增Sjcb2基因。

1．2．3免疫組化法檢測(cè)Sjcb2基因在小鼠肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 在末次免疫后14 d，每組取3只小鼠，其股四頭肌用4% 甲醛固定4 h后，常規(guī)做石蠟切片，用免疫組化檢測(cè)，并置光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照。

1．2．4攻擊感染及免疫效果測(cè)定 第3次免疫后14 d 每鼠經(jīng)腹部皮膚感染40條活尾蚴，飼養(yǎng)42 d后麻醉處死全部小鼠；用生理鹽水經(jīng)門靜脈灌注，收集成蟲和計(jì)數(shù)，然后將肝臟取出并拍照，秤重后剪碎置于10 mL 5%KOH溶液中，37 ℃消化24 h，進(jìn)行蟲卵計(jì)數(shù)，根據(jù)獲得的成蟲和蟲卵數(shù)量計(jì)算出減蟲率和減卵率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1．2．5MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞體外增殖試驗(yàn) 尾蚴攻擊感染前2周每組取5只小鼠剖殺，進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)。小鼠脾淋巴細(xì)胞的分離與小鼠脾細(xì)胞的細(xì)胞因子檢測(cè)，臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔103～104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL，每組分別用培養(yǎng)液、可溶性成蟲抗原(soluble worm antigen, SWA)10 μg/mL和PHA 進(jìn)行刺激，培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，800 r/min離心15 min離心棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，檢測(cè)每孔OD570nm值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1．2．6細(xì)胞因子測(cè)定 于尾蚴攻擊感染前2周及攻擊感染后10 d，每組取5只小鼠，在無菌條件麻醉后處死小鼠，分別取其脾臟進(jìn)行研磨，用200目尼龍網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，加入適量0.83% NH4Cl溶解紅細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，細(xì)胞中加入PBS洗滌1次，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，加入含10% 小牛血清的 RPMI 1640完全培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色法對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×106/mL，接種于24孔板中，1 mL /孔；每組分別用10 μg/mL 的SWA或PHA刺激，空白孔加培養(yǎng)液；置CO2培養(yǎng)箱37 ℃ 培養(yǎng)72 h，離心取上清，采用雙抗體夾心法檢測(cè)細(xì)胞因子含量。

1．2．7抗體水平的檢測(cè) 分別于免疫前、第1次免疫后第1 d、3 d、7 d、10 d、14 d及第2次免疫后14 d、第3次免疫后14 d及尾蚴攻擊感染后10 d采血，分離小鼠血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。以Sjcb2為抗原，免疫后小鼠血清為待測(cè)血清，采用間接ELISA法檢測(cè) IgG 抗體滴度。將Sjcb2稀釋至10 μg/mL，將待測(cè)血清按1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640和1∶1 280進(jìn)行稀釋，每孔加入碳酸鹽緩沖液稀釋的Sjcb2抗原100 μL，4 ℃包被過夜(或37 ℃ 2 h)，用PBST洗板3次，每次5 min；每孔加入封閉液300 μL，37 ℃溫育 2 h，PBST洗板3次；每孔加入稀釋后待檢血清 100 μL，37℃作用 1.5 h，PBST洗板3次；每孔加入稀釋后酶標(biāo)二抗 100 μL，37 ℃ 作用1.5 h，PBST洗板3次；每孔加入底物 100 μL，37 ℃避光反應(yīng) 30 min。終止反應(yīng)后測(cè)定 OD490nm值。

2 結(jié) 果

2．1Sjcb2基因片段的體外擴(kuò)增 提取 pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒DNA，以其為模板特異性擴(kuò)增Sjcb2基因片段，結(jié)果顯示：能特異性擴(kuò)增出約1 100 bp的新條帶，大小與Sjcb2基因片段相符(見圖1)。

圖1PCR擴(kuò)增Sjcb2基因

Fig.1AmplificationofSjcb2genebyPCR

1：pcDNA3.1(+)/Sjcb2為模板(pcDNA3.1 (+)/Sjcb2 as a template); 2: pcDNA3.1為模板(pcDNA3.1 as a template); M: DNA Marker

2．2pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒的酶切鑒定 將pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定確認(rèn)后，用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后可見大小為1 100 bp條帶，與Sjcb2基因片段大小相符(見圖2)。

圖2pcDNA3.1(+)/Sjcb2雙酶切鑒定

Fig.2IdentificationofpcDNA3.1(+)/Sjcb2bydoubleenzyme

M: DNA markers; 1: 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/Sjcb2 (The recombinant plasmid of pcDNA3.1 (+)/Sjcb2); 2: pcDNA3.1(+)/Sjcb2EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切 (pcDNA3.1(+)/Sjcb2 digested byEcoRⅠandXbaⅠ)；3: PCR產(chǎn)物(PCR products)

2．3PCR法檢測(cè) pcDNA3.1(+)/Sjcb2核酸疫苗的穩(wěn)定性 在DNA疫苗免疫后的不同時(shí)間點(diǎn)，用PCR法檢測(cè)小鼠股四頭肌組織內(nèi)Sjcb2基因片段，結(jié)果顯示：疫苗組均能擴(kuò)增出Sjcb2特異性條帶，而pcDNA3.1組和生理鹽水組均未擴(kuò)增出條帶(圖3)。

圖3PCR檢測(cè)pcDNA3.1(+)/Sjcb2在肌肉組織內(nèi)的穩(wěn)定性

M：DNA Maker；1: 非免疫小鼠(None immunized group); 2: 生理鹽水組(saline group); 3: pcDNA3.1(+)組(pcDNA3.1(+)group); 4: pcDNA3.1(+)/Sjcb2組(pcDNA3.1(+) /Sjcb2 group); 5: PCR產(chǎn)物(PCR products)

Fig.3DetectionofthestabilityofpcDNA3.1(+)/Sjcb2inthemuscletissuebyPCR

2．4免疫組化法檢測(cè)Sjcb2基因在小鼠肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 取小鼠后腿股四頭肌組織制備切片，按SABC試劑盒說明書操作，結(jié)果顯示：pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒組小鼠肌細(xì)胞區(qū)域可見棕黃色顆粒(圖4)。

圖4免疫組化法檢測(cè)Sjcb2基因在小鼠肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

Fig.4DetectionofSjcb2expressioninthemusclecellsofmicebyimmunohistochemicalstain

A: Vaccine group (10×10);

B: Control group (10×10);

C: Vaccine group (10×20);

D: Control group (10×20).

2．5MTT法體外檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖 結(jié)果顯示：疫苗組脾淋巴細(xì)胞受SWA刺激后顯著增殖，OD570nm值達(dá)0.4092±0.0138，DNA疫苗組與pcDNA3.1組和生理鹽水組比較，在SWA或PHA處理時(shí)，脾淋巴細(xì)胞增殖有顯著性差異，P<0.05；未加刺激物處理時(shí)，無明顯差異，P>0.05；pcDNA3.1組和生理鹽水組比較，SWA和PHA處理均無顯著性差異，P>0.05(圖5)。

圖5MTT法檢測(cè)免疫后小鼠脾細(xì)胞增殖

Fig.5DeterminedproliferationrateofimmunizedmicespleencellsbyMTTmethod

2．6細(xì)胞因子檢測(cè) 尾蚴攻擊攻擊前2周，分別取各組小鼠脾細(xì)胞加入PHA或SWA進(jìn)行刺激，結(jié)果顯示：DNA疫苗組分泌IFN-γ的水平顯著高于pcDNA3.1組和生理鹽水組，P<0.01，未加刺激物處理時(shí)，則無顯著性差異，P>0.05；pcDNA3.1組和生理鹽水組比較，SWAP和PHA處理均無顯著性差異，P>0.05。攻擊感染前分泌IL-4的水平，DNA疫苗組與pcDNA3.1組和生理鹽水組相比均無顯著性差異(P>0.05)。尾蚴攻擊感染后10 d，脾細(xì)胞培養(yǎng)液中加入PHA或SWA刺激時(shí)，DNA疫苗組IFN-γ仍維持較高水平，與pcDNA3.1組和生理鹽水組比較均有顯著性差異(P<0.01)。攻擊感染后，IL-4的水平在DNA疫苗組與pcDNA3.1組和生理鹽水組相比無顯著性差異(P>0.05)。攻擊感染后與攻擊感染前比較，DNA疫苗組、pcDNA3.1組和生理鹽水組脾細(xì)胞分泌IFN-γ的水平均無顯著性差異，P>0.05(圖6)；而分泌 IL-4的水平均在感染攻擊后顯著升高，P<0.05，且pcDNA3.1組和生理鹽水組升高程度極為顯著，P<0.01(圖7)。

圖6攻擊感染前后小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ水平

Fig.6TheIFN-γlevelsofspleencellculturesupernatantofmicebeforeandafterattackinfection

圖7攻擊感染前后小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-4水平

Fig.7IL-4levelsofspleencellculturesupernatantofmicebeforeandafterattackinfection

2.7抗體水平的檢測(cè) DNA疫苗組在第1次免疫后7 d可從血清中檢測(cè)出抗體，之后持續(xù)升高，第14 d達(dá)高峰，IgG抗體滴度為1∶1 280；而生理鹽水組和pcDNA3.1組抗體滴度無顯著變化。尾蚴攻擊感染后與攻擊感染前比較，抗體水平在DNA疫苗組稍有下降，但無顯著性變化，而在pcDNA3.1組和生理鹽組則顯著性增加，P<0.05(圖8)。

2．8動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)

2．8．1肝臟蟲卵計(jì)數(shù)及小鼠荷成蟲對(duì)數(shù) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：pcDNA3.1(+)/Sjcb2核酸疫苗組分別與pcDNA3.1(+)組和生理鹽水組比較，肝臟蟲卵數(shù)及小鼠荷成蟲對(duì)數(shù)均有顯著性減少，P<0.05，而pcDNA3.1(+)組與生理鹽水組之間無顯著性差異，P>0.05(表1)。

2．8．2計(jì)算減蟲率和減卵率

減蟲率(%)=(生理鹽水組荷蟲數(shù)-疫苗組荷蟲數(shù))/ 生理鹽水組荷蟲數(shù)×100%=36.32%

減卵率(%)=(生理鹽水組蟲卵數(shù)-疫苗組蟲卵數(shù))/ 生理鹽水組蟲卵數(shù)×100%=60.61%

3 討 論

血吸蟲感染后保護(hù)性免疫機(jī)制復(fù)雜，目前尚無令人滿意的血吸蟲疫苗[8]。近年來，國(guó)內(nèi)外血吸蟲核酸疫苗研究較多，但核酸疫苗的作用機(jī)理及確切效果尚需進(jìn)一步研究和證實(shí)[9-10]。

圖8DNA疫苗免疫后小鼠抗體滴度變化

Fig.8AntibodytitersofmiceafterDNAvaccineimmunization

Ⅰ-1d: First day after the first immunization;

Ⅰ-3d: Third day after the first immunization;

Ⅰ-7d: Seventh day after the first immunization;

Ⅰ-10d: Tenth day after the first immunization;

Ⅰ-14d: Fourteenth day after the first immunization;

Ⅱ-14d: Fourteenth day after the second immunization;

Ⅲ-14d: Fourteenth day after the third immunization;

Attack-10d: Tenth day after cercariae attack.

表1 pcDNA3.1(+)/Sjcb2核酸疫苗免疫后小鼠荷成蟲對(duì)數(shù)及肝臟蟲卵數(shù)

本實(shí)驗(yàn)將Sjcb2作為日本血吸蟲疫苗候選分子，構(gòu)建核酸疫苗免疫小鼠，經(jīng)PCR和免疫組化法驗(yàn)證pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒能在小鼠股四頭肌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在及高效表達(dá)，說明該核酸疫苗在動(dòng)物體內(nèi)具有一定穩(wěn)定性和良好的表達(dá)狀態(tài)，這些特性是產(chǎn)生保護(hù)性免疫作用的基礎(chǔ)?？贵w檢測(cè)顯示DNA疫苗組在免疫后一周出現(xiàn)抗體，第2周達(dá)高峰，Sjcb2抗體滴度可達(dá)1∶1 280，提示該核酸疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平抗體及具有一定的體液免疫作用，尾蚴攻擊感染后10 dSjcb2抗體滴度稍有下降，但無顯著性差異，可能是其抗體與蟲體產(chǎn)生的Sjcb2特異性結(jié)合，發(fā)揮抗蟲作用，故抗體水平有所下降。但由于血吸蟲感染第10 d時(shí)蟲體發(fā)育尚未成熟，分泌的Sjcb2抗原有限，抗體水平下降不明顯。此結(jié)果說明特異性Sjcb2抗體在抗血吸蟲感染時(shí)并非在早期發(fā)揮作用，可能主要在蟲體成熟及產(chǎn)卵時(shí)發(fā)揮作用。MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示DNA疫苗組脾淋巴細(xì)胞增殖顯著，說明核酸疫苗能誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和活化，提示Sjcb2不僅能誘導(dǎo)體液免疫，而且可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，可能通過體液免疫和細(xì)胞免疫發(fā)揮抗感染作用。

細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示：小鼠接種Sjcb2 DNA疫苗后，IFN-γ水平顯著升高，而pcDNA3.1空質(zhì)粒和生理鹽水則不能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生IFN-γ，血吸蟲尾蚴攻擊感染后，也未能有效誘導(dǎo)小鼠分泌IFN-γ。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，且能促進(jìn)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Sjcb2 DNA疫苗比血吸蟲尾蚴感染更能有效刺激小鼠產(chǎn)生IFN-γ，誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞保護(hù)性免疫應(yīng)答。小鼠接種Sjcb2 核酸疫苗、pcDNA3.1空質(zhì)粒和生理鹽水后，IL-4水平與接種前比無顯著差異，但血吸蟲尾蚴攻擊感染后，能顯著性誘導(dǎo)各組產(chǎn)生高水平IL-4，其中Sjcb2核酸疫苗IL-4水平低于其它兩組。說明Sjcb2 核酸疫苗不能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生IL-4，但血吸蟲感染可誘導(dǎo)小鼠分泌IL-4。IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌，能促進(jìn)Th2型細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生免疫病理反應(yīng)，同時(shí)也是IgE轉(zhuǎn)化因子，可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞活化，發(fā)揮抗蟲作用[12]。

在血吸蟲感染中，T細(xì)胞應(yīng)答發(fā)揮著重要作用，在小鼠Th1型細(xì)胞應(yīng)答可產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫，而Th2型細(xì)胞應(yīng)答則主要產(chǎn)生免疫病理作用，Th1/Th2細(xì)胞間失衡可導(dǎo)致肝臟免疫病理損傷。Th1和Th2細(xì)胞之間可通過其分泌的細(xì)胞因子相互作用，Th1型細(xì)胞可通過分泌IFN-γ抑制Th2型細(xì)胞增殖與活化，Th2型細(xì)胞通過分泌IL-4抑制Th1型細(xì)胞增殖與活化[13]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測(cè)：Sjcb2 DNA疫苗經(jīng)肌肉注射小鼠后，表達(dá)的Sjcb2分子經(jīng)抗原提呈細(xì)胞處理后，能激活T細(xì)胞，誘導(dǎo)其產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ，而IFN-γ又能促進(jìn)Th1細(xì)胞分化與增殖，從而發(fā)揮保護(hù)性免疫作用。血吸蟲感染后，主要誘導(dǎo)IL-4水平升高，從而促進(jìn)Th2型細(xì)胞增殖和分化，參與日本血吸蟲肝腸蟲卵肉芽腫形成和免疫病理損傷。

小鼠所荷成蟲對(duì)數(shù)和肝臟荷蟲卵數(shù)結(jié)果顯示：Sjcb2 DNA疫苗組與其它兩組比較，小鼠所荷成蟲對(duì)數(shù)顯著性減少，P<0.05；小鼠肝臟所荷蟲卵數(shù)，Sjcb2 疫苗組顯著性低于其它兩組，P<0.05。Sjcb2 DNA疫苗組減蟲率為36.32%，減卵率為60.61%，說明Sjcb2能誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)性作用。

綜上所述，Sjcb2在小鼠體內(nèi)能誘導(dǎo)相應(yīng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，可作為抗日本血吸蟲核酸疫苗的候選分子，能誘導(dǎo)以Th1型細(xì)胞為主的保護(hù)性免疫應(yīng)答，減輕血吸蟲感染所致的免疫病理反應(yīng)和病理損傷。但由于核酸疫苗的免疫保護(hù)效果受多種因素的影響，該核酸疫苗誘導(dǎo)小鼠的免疫保護(hù)作用未能產(chǎn)生理想的預(yù)防效果。因此，采用Sjcb2與血吸蟲疫苗的其它候選分子聯(lián)合免疫，進(jìn)一步使疫苗的保護(hù)性作用達(dá)到最佳水平，將是我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)。

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