張紅濤，鄧百萬,2，陳文強(qiáng),2，劉開輝,2，丁小維,2，顧東升，李華

(1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000； 2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心， 陜西 漢中 723000; 3.勉縣第一中學(xué)， 陜西 勉縣 724200)

0 引 言

內(nèi)生菌是指生活在植物體內(nèi)的某一階段，不引起植物組織明顯病害的微生物[1]。內(nèi)生菌包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌和內(nèi)生真菌。內(nèi)生菌的特殊生境決定了其次級代謝產(chǎn)物的獨特性。近幾年來，有關(guān)內(nèi)生菌的研究主要集中于藥用植物，大量研究表明，內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相近的活性物質(zhì)。例如從桃耳七內(nèi)生菌中分離得到鬼臼類化合物[2]，從紅豆杉內(nèi)生菌檢測到巴卡亭Ⅲ[3]，Rangarajulu S K等[4]從銀杏中分離得到產(chǎn)紫杉醇類物質(zhì)的內(nèi)生真菌。這些都表明利用內(nèi)生真菌產(chǎn)生活性物質(zhì)有著十分廣闊的前景。

紫杉醇(Paclitaxel)是三環(huán)二萜類生物堿[5]，具有廣譜抗癌性，對胸腺癌有著較好的療效。自Stierle等[6]首次從紅豆杉中分離出產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌紫杉霉(TaxomycesAndreanae)后，使得用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇成為一種新的解決紫杉醇缺乏的途徑。由于紫杉醇對乳腺癌、肺癌等具有較好的控制和治療功效[7-8]，在醫(yī)療領(lǐng)域的需求量不斷增加，目前已經(jīng)出現(xiàn)了資源短缺。近年來，微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇被認(rèn)為是解決紫杉醇生產(chǎn)原料危機(jī)的良好方法。但由于單位發(fā)酵液產(chǎn)生的紫杉醇量很低，還沒有一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌用于工業(yè)化生產(chǎn)。從紅豆杉中尋找產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，無疑能為解決紫杉醇生產(chǎn)原料危機(jī)提供新的途徑。

秦巴山區(qū)微生物資源豐富，有利于人們尋找新的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生菌資源。本文從中國紅豆杉中再次分離產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，并對其進(jìn)行菌種鑒定和代謝產(chǎn)物檢測，以便獲得新的產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 紅豆杉

中國紅豆杉(Taxuschinensis)采自于陜西省佛坪縣三官廟鄉(xiāng)山林地，經(jīng)陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院楊培君教授鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基

綜合馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，KH2PO45.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，維生素B10.01g，瓊脂12.0 g，H2O 1 000 mL，pH自然。

查氏培養(yǎng)基：蔗糖30.0 g，NaNO32.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂12.0 g，H2O 1 000 mL，pH自然。

1.1.3 主要儀器

高級顯微鏡(Nikon Eclipse Ti-S，尼康公司)、PCR儀(BIO-RAD，美國BIO-RAD公司)、凝膠電泳儀(TANON EPS300，上海天能科技有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(IKA RV10，上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司)、高效液相色譜儀(Agilent 1200，美國Agilent公司)、質(zhì)譜儀(Agilent 1100LC/MSD，美國Agilent公司)。

1.2 方 法

1.2.1 內(nèi)生真菌分離與純化

先將采集來的新鮮枝條置于自來水下沖洗4 h，將剝開的樹皮在超凈工作臺中先用體積分?jǐn)?shù)70%的酒精消毒30 s，無菌水沖洗4次，再用體積分?jǐn)?shù)0.1% 的HgCl2消毒7 min后用無菌水清洗4次，將最后一次的洗液涂布于CPDA固體培養(yǎng)基上，作為對照組以檢驗是否消毒徹底。將處理好的材料用無菌研缽研磨至漿狀，并涂布于CPDA上。把涂布好的培養(yǎng)皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)觀察對照組的平板無菌長出，而實驗組平板上長出菌絲后，及時將實驗組平板上的菌塊挑到新的CPDA培養(yǎng)基，重復(fù)多次即可純化。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

用插片法將純化的菌株接于查氏培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱下培養(yǎng)。待菌絲著生在蓋玻片上時，將玻片取出，用棉蘭染色，進(jìn)行顯微鏡觀察并初步分類。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

挑取適量菌移入Ep管中，加入CTAB提取緩沖液800 μL，混勻置于65 ℃水浴，每5 min輕輕震蕩幾次，30 min后12 000 rpm離心15 min，吸取上清液，加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇溶液(25∶24∶1)混合振蕩20 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加取上清液一半體積的異丙醇，-20 ℃冷凍30 min，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗滌沉淀2次，待晾干后溶于40 μL TE緩沖液中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

18S rDNA序列擴(kuò)增：使用真菌18S rDNA通用引物序列：NS1(5’-GTAGTCATATGCTT GTCTC-3’)，NS6(5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’)。用CTAB法獲得的真菌基因組作為模板，以18S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，模板1.0 μL，引物P1、P2各1.0 μL，Taq酶0.5 μL，加去離子水至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，36個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，并把膠回收。純化后送由上海生工進(jìn)行測序，把所得序列經(jīng)BLAST比對分析，下載高相似度的序列，利用Mega 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[9]。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物提取及檢測

將其中Tax-4菌株接種至CPDA培養(yǎng)基上，28 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。用等體積乙酸乙酯萃取3次，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上低壓旋蒸至干燥。用少量甲醇溶解干燥物并定容至10 mL。

標(biāo)準(zhǔn)品配制：精確稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，用10 mL甲醇溶解，配成100 mg/L母液備用。并逐步稀釋到0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

HPLC色譜條件：流動相為甲醇∶水=35∶65(V∶V)，流速1 μL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長228 nm，柱溫30 ℃，色譜柱C18(4.6 mm×150 mm)。

回歸方程：y=6.087 8+3 589.391 3x(r=0.999 2)。

HPLC-MS檢測條件：流動相同上，碰撞電壓2 200 V，流速2 μL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織表面消毒檢驗

在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，對照組無其它菌長出，而實驗組長出真菌，證明材料表面消毒徹底，實驗組長出的是紅豆杉的內(nèi)生真菌，而不是組織材料的表面附生菌。

2.2 內(nèi)生真菌的分離及菌株Tax-4的形態(tài)學(xué)特征

(a)正面 (b)反面圖1 Tax-4菌落特征

圖2 菌株Tax-4的形態(tài)學(xué)特征

從秦巴山區(qū)紅豆杉鮮嫩樹皮中分離到45株真菌，其中Tax-4菌株在CPDA培養(yǎng)基上的生長速度較慢。28 ℃培養(yǎng)7 d后觀察菌落形態(tài)和菌絲顯微觀察，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1結(jié)果顯示，菌落正面灰黑色，菌絲發(fā)達(dá)，中間顯灰黑色，質(zhì)地疏松，背面培養(yǎng)基中心顯黃色。圖2結(jié)果顯示：菌絲有隔，較粗壯，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)呈球形。孢子表面光滑，呈現(xiàn)灰黑色。依據(jù)形態(tài)特征，結(jié)合文獻(xiàn)[10]可初步確定為黑團(tuán)殼屬(Massaria)。

2.3 Tax-4的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用18S rDNA通用引物(NS1和NS6)對內(nèi)生真菌Tax-4進(jìn)行序列擴(kuò)增，獲得一個880 bp左右的單一DNA條帶，并對純化的DNA條帶進(jìn)行測序分析并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖3所示。圖3結(jié)果顯示，內(nèi)生真菌Tax-4(登錄號：KF193057)同黑團(tuán)殼屬聚于同一分支，步長值為100。內(nèi)生真菌Tax-4同已有的序列的同源性高達(dá)99%以上。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，該菌株可鑒定為黑團(tuán)殼屬(Massaria，Tax-4)。

圖3 菌株Tax-4的18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 Tax-4的發(fā)酵產(chǎn)物檢測結(jié)果

利用高效液相對Tax-4菌株發(fā)酵液和紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，發(fā)酵液中有紫杉醇，檢測結(jié)果見圖4。圖4(a)結(jié)果顯示，樣品在12.559 min出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰；圖4(b)結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)品在保留時間為12.565 min時出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰。同樣條件下，可以初步判定樣品與標(biāo)準(zhǔn)品二者屬于同一種物質(zhì)。

(a)樣品 (b)標(biāo)準(zhǔn)品圖4 菌株Tax-4產(chǎn)紫杉醇的HPLC檢測

液質(zhì)聯(lián)用分析：如圖5(a)，標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生m/z為864.2的M+H的離子峰和m/z為876.2的M+Na+的離子峰；如圖5(b)，樣品產(chǎn)生m/z為852.3的離子峰和m/z為875.8的M+Na+的離子峰。由此，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜特征離子峰大致一樣，可說明Tax-4發(fā)酵液中含有紫杉醇。

(a)標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果 (b)樣品檢測結(jié)果圖5 菌株Tax-4產(chǎn)紫杉醇的HPLC-MS檢測結(jié)果

3 討 論

從紅豆杉中分離出一種內(nèi)生真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和18S rDNA等分子生物學(xué)手段將其鑒定為黑團(tuán)殼屬。通過對該菌株發(fā)酵液進(jìn)行HPLC及HPLC-MS檢測，發(fā)現(xiàn)該菌能夠產(chǎn)生紫杉醇。經(jīng)筆者統(tǒng)計，目前發(fā)現(xiàn)產(chǎn)紫杉醇真菌的大概有曲霉屬、瘤座菌屬、根霉屬、鐮刀菌屬、肉座菌屬、鏈格孢屬等20多個屬。有關(guān)黑團(tuán)殼屬產(chǎn)紫杉醇類物質(zhì)尚屬首次報道，無疑為發(fā)現(xiàn)產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的菌株提供了新的途徑。

產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的發(fā)現(xiàn)是紫杉醇資源研究所取得的重要成就,由于內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇技術(shù)成熟[11]，而且內(nèi)生真菌生長迅速、周期短，目前已成為解決紫杉醇藥物緊缺的有效途徑[12-13]。因此，尋找更多產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的資源有待進(jìn)一步研究。

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