王曉天 劉曉梅 尤紅娟 李小翠 秦蘇萍 湯仁仙* 鄭葵陽

（徐州醫(yī)學院病原生物學與免疫學教研室，江蘇 徐州 221004）

p38MAPK介導的Fas/FasL凋亡通路在缺血性腦損傷中的作用研究

王曉天 劉曉梅 尤紅娟 李小翠 秦蘇萍 湯仁仙* 鄭葵陽

（徐州醫(yī)學院病原生物學與免疫學教研室，江蘇 徐州 221004）

目的 探討p38MAPK介導的Fas/FasL凋亡通路在大鼠缺血性腦損傷中的作用。方法 ①制作大鼠全腦缺血模型，免疫印跡法檢測假手術組、腦缺血復灌6 h、12 h、1 d、3 d組p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表達。②免疫印跡法檢測假手術組、缺血復灌組、溶劑對照組和SB203580組p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表達。結(jié)果 ①與假手術組相比，腦缺血再灌注6 h、12 h、1 d、3 d組p-p38MAPK蛋白表達水平逐漸升高，于1 d達高峰（P均＜0.05）。②與缺血復灌組和溶劑對照組相比，SB203580組p-p38MAPK、FasL和Caspase-3表達水平顯著降低（P均＜0.05）。結(jié)論 p38MAPK介導的Fas/FasL凋亡通路在缺血性腦損傷中發(fā)揮了重要作用。

p38MAPK；Fas；FasL；凋亡；腦缺血

p38MAPK是MAPK信號通路的重要成員，在炎性反應、應激、休克、細胞遷移等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。最近研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號通路與腦缺血性神經(jīng)元凋亡關系密切。p38MAPK調(diào)控細胞凋亡的機制非常復雜[3-7]，其中p38 MAPK可通過增強Fas/FasL表達促進細胞的凋亡[5]。為此，本實驗利用大鼠全腦缺血模型，通過注射p38MAPK特異性阻斷劑SB203580，觀察其對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)中p-p38MAPk、p38MAPK、FasL、Fas、Caspase-3蛋白表達的影響，探討p38MAPK介導的Fas/FasL凋亡通路在缺血性腦損傷中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：正常健康雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量250～300 g，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑：p-p38MAPK，p38MAPK，F(xiàn)as，F(xiàn)asL抗體購于Santa Cruz Biotechnology公司，active-Caspase-3抗體購于Sigma公司，SB203580購于Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及動物分組：25只SD大鼠均分為5組：假手術組、腦缺血復灌6 h、12 h、1 d、3 d組。采用四動脈結(jié)扎法制作全腦缺血模型[8]，將大鼠麻醉后，分離其雙側(cè)頸總動脈并電凝椎動脈，次日于清醒狀態(tài)下結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，全腦缺血15 min，再灌注不同時間處死。假手術組的處理同缺血復灌組，但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。

1.2.2 腹腔注射阻斷劑SB203580及動物分組：20只大鼠均分為4組：假手術組、缺血復灌組、溶劑對照組和SB203580組。SB203580組于腦缺血前30 min腹腔注射SB203580（5 mg/kg，溶于5 mg/mL DMSO）[9]；溶劑對照組于缺血前30 min腹腔注射等體積的DMSO。4組大鼠皆全腦缺血15 min，再灌注1 d處死。

1.2.3 樣本制備：各組SD大鼠作不同處理后，斷頭快速取腦，分離雙側(cè)海馬，沿海馬裂將其分為CA1和CA3-DG兩部分。CA1部分加勻漿緩沖液，勻漿，1000×g離心15 min，小心移取上清液，主要為海馬的胞質(zhì)部分，BCA法測蛋白濃度后行免疫印跡分析。

1.2.4 免疫印跡：取等量的變性蛋白質(zhì)樣本，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育2 h，顯色。掃描膜上顯色條帶并用ImageJ軟件分析，蛋白表達相對值以各組蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值來表示。

2 結(jié) 果

2.1 腦缺血再灌注不同時間p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表達水平的比較：與假手術組相比，腦缺血再灌注6 h、12 h、1 d、3 d組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)中p-p38MAPK蛋白表達水平逐漸升高，于1 d達高峰，3 d又有所降低，且差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），而胞質(zhì)中p38MAPK蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 4組p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表達水平的比較：與假手術組相比，缺血復灌組、溶劑對照組和SB203580組p-p38MAPK、FasL和Caspase-3表達水平明顯增多；與缺血復灌組和溶劑對照組相比，SB203580組p-p38MAPK、FasL和Caspase-3表達水平顯著降低（P均＜0.05）。溶劑對照組與缺血復灌組相比，p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。4組p38MAPK、Fas蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表2。

表1 腦缺血再灌注不同時間p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表達水平的比較（，n=5）

表1 腦缺血再灌注不同時間p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表達水平的比較（，n=5）

注：與假手術組相比，*P＜0.05

蛋白表達相對值 假手術組 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注1 d 再灌注3 d p-p38MAPK 0.253±0.027 0.394±0.031* 0.561±0.043* 0.676±0.048* 0.531±0.041* p38MAPK 0.532±0.041 0.543±0.041 0.556±0.042 0.527±0.040 0.548±0.042

表2 4組p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表達水平的比較（，n=5）

表2 4組p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表達水平的比較（，n=5）

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與缺血復灌組和溶劑對照組相比，△P＜0.05

蛋白表達相對值 假手術組 缺血復灌組 溶劑對照組 SB203580組p-p38MAPK 0.251±0.027 0.673±0.048* 0.652±0.047* 0.425±0.036*△p38MAPK 0.521±0.040 0.542±0.041 0.535±0.041 0.554±0.042 FasL 0.263±0.028 0.767±0.050* 0.748±0.049* 0.456±0.037*△Fas 0.465±0.037 0.482±0.039 0.457±0.037 0.471±0.039 Caspase-3 0.213±0.025 0.687±0.048* 0.701±0.049* 0.394±0.032*△

3 討 論

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是細胞內(nèi)信號傳遞的交匯點，可將細胞外信息傳遞至細胞核，直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，調(diào)控基因表達[10]。p38MAPK是MAPK信號通路的重要成員，在炎性反應、休克、細胞遷移、細胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號通路與缺血性腦損傷密切相關[11]。大鼠局灶性腦缺血再灌注24 h，缺血區(qū)腦組織p38MAPK的活性增強并伴隨神經(jīng)元的凋亡，表明p38MAPK在腦缺血后神經(jīng)元凋亡的過程中起重要作用[12-13]。我們的實驗結(jié)果也顯示：大鼠全腦缺血再灌注后6 h、12 h、1 d、3 d，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)中p-p38MAPK蛋白表達水平逐漸升高，于1 d時達高峰，而胞質(zhì)中p38MAPK蛋白表達水平無明顯差異。結(jié)果提示：腦缺血再灌注后有p38MAPK的激活。

p38 MAPK經(jīng)多條途徑調(diào)控細胞凋亡，其中p38 MAPK可通過增強Fas/FasL表達促進細胞的凋亡。Fas蛋白是細胞凋亡信號的受體，F(xiàn)as配體（FasL）屬腫瘤壞死因子超家族。Fas/FasL系統(tǒng)在細胞凋亡中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[14]，在小鼠局灶性腦缺血模型中，腦缺血模型組FasL表達比假手術組增加了451.67%。而我們以前的實驗結(jié)果[15]也顯示：腦缺血再灌注后FasL表達增高。為了證實在腦缺血復灌過程中p38 MAPK是否可通過Fas/FasL通路促進細胞凋亡，我們選用了p38MAPK的特異性阻斷劑SB203580作為工具藥進行研究。SB203580是吡啶咪唑芳基雜環(huán)類化合物，與p38MAPK競爭性結(jié)合ATP位點，使p38MAPK失去與ATP結(jié)合的能力，從而高效抑制p38MAPK的磷酸化，使其失去激酶活性，最終實現(xiàn)對p38MAPK通路的抑制。我們的結(jié)果顯示：與缺血復灌組和溶劑對照組相比，SB203580組p-p38MAPK、FasL和Caspase-3表達水平顯著降低；而p38MAPK、Fas蛋白表達水平無明顯差異。提示：p38MAPK可通過Fas/FasL信號通路誘導神經(jīng)元凋亡。

總之，本實驗證實了腦缺血復灌過程中有p38MAPK的激活，并通過其阻斷劑SB203580證實p38MAPK能經(jīng)Fas/FasL信號通路誘導神經(jīng)元凋亡。因此，p38MAPK介導的Fas/FasL凋亡通路在缺血性腦損傷中發(fā)揮了重要作用，為臨床進一步闡明人類腦缺血發(fā)病機制提供了實驗依據(jù)，且為防治人類缺血性腦病提供了新的思路。

[1] 劉會,榮季冬,袁國軍,等.阿托伐他汀對慢性心力衰竭小鼠心肌組織賴氨酰氧化酶表達的影響[J].中華老年心腦血管病雜志,2013,15(6):628-631.

[2] Huang H,Song TJ,Li X,et al.BMP signaling pathway is required for commitment of C3H10T1/2 pluripotent stem cells to the adipocyte lineage[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(31):12670-12675.

[3] Cannell IG,Kong YW,Johnston SJ,et al.p38 MAPK/MK2-mediated induction of miR-34c following DNA damage prevents Myc-dependent DNA replication[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(12):5375-5380.

[4] Lamy V,Bousserouel S,Gossé F,et al.Lupulone triggers p38 MAPK-controlled activation of p53 and of the TRAIL receptor apoptotic pathway in human colon cancer-derived metastatic cells[J].Oncol Rep,2011,26(1):109-114.

[5] Liu WH,Cheng YC,Chang LS.ROS-mediated p38alpha MAPK activation and ERK inactivation responsible for upregulation of Fas and FasL and autocrine Fas-mediated cell death in Taiwan cobra phospholipase A(2)-treated U937 cells[J].J Cell Physiol,2009,219(3):642-651.

[6] So KS,Oh JE,Han JH,et al.Induction of apoptosis by a stilbene analog involves Bax translocation regulated by p38 MAPK and Akt[J].Arch Pharm Res,2008,31(4):438-444.

[7] Li T,Feng Z,Jia S,et al.Daintain/AIF-1 promotes breast cancer cell migration by up-regulated TNF-α via activate p38 MAPK signaling pathway[J].Breast Cancer Res Treat,2012,131(3):891-898.

[8] 袁鳳剛,郝艷玲,張春平.MK801對大鼠全腦缺血/再灌注ASK1信號通路影響以及神經(jīng)元的保護[J].中國藥理學通報,2014,30(2):179-185.

[9] 余音,郭倩,潘乾廣,等.絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導通路在腦缺血再灌注損傷中的作用及機制[J].中國生物制品學雜志,2013, 26(11): 1544-1550.

[10] 李國輝,王耀輝.p38信號通路與缺血性腦卒中[J].中華老年心腦血管病雜志,2014,16(7):779-780.

[11] 王耀輝,李國輝.p38MAPK在大鼠腦缺血再灌注腦組織AQP4表達變化及腦水腫形成中的作用[J].中風與神經(jīng)疾病雜志,2013,30(8):700-702.

[12] 李浩,張多斌,吳嵐,等.丹參酮ⅡA對腦缺血再灌注損傷大鼠磷酸化p38 MAPK和MMP-9表達及細胞凋亡的影響[J].中風與神經(jīng)疾病雜志,2013,30(3):229-233.

[13] Roy Choudhury G,Ryou MG,Poteet E,et al.Involvement of p38 MAPK in reactive astrogliosis induced by ischemic stroke[J]. Brain Res,2014,1551:45-58.

[14] Niu FN,Zhang X,Hu XM,et al.Targeted mutation of Fas ligand gene attenuates brain inflammation in experimental stroke[J]. Brain Behav Immun,2012,26(1):61-71.

[15] Pei DS,Wang XT,Liu Y,et al.Neuroprotection against ischaemic brain injury by a GluR6-9c peptide containing the TAT protein transduction sequence[J].Brain,2006,129(Pt 2):465-479.

Study of the Effects of Apoptosis Induced by p38MAPK through Fas/FasL Pathway on Ischemic Brain Injury

WANG Xiao-tian, LIU Xiao-mei, YOU Hong-juan, LI Xiao-cui, QIN Su-ping, TANG Ren-xian*, ZHENG Kui-yang
(Department of Pathogenic Biology and Immunology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China)

Objective Investigate the effects of apoptosis induced by p38MAPK through Fas/FasL pathway on ischemic brain injury in rats. Methods ①Making rat model of cerebral ischemia, p-p38MAPK and p38MAPK protein expression were detected by immunoblotting in sham operation group, ischemiareperfusion(I/R) 6 h, 12 h, 1 d, 3 d group. ②p-p38MAPK, p38MAPK, FasL, Fas and Caspase-3 protein expression were detected by immunoblotting 1d after I/R in sham operation group, I/R group, solvent control group and SB203580 group. Results ①Compared with the sham operation group, p-p38MAPK protein expression were increased gradually in I/R 6 h, 12 h, 1 d, 3 d group, and reached the peak in I/R 1d group (All P＜0.05). ②Compared with the I/R group and solvent control group, p-p38MAPK、FasL and Caspase-3 protein expression were decreased in SB203580 group (All P＜0.05). Conclusion Neuronal apoptosis induced by p38MAPK through Fas/FasL pathway played important effects on ischemic brain injury in rats.

p38MAPK; Fas; FasL; Apoptosis; Cerebral ischemia

R651.1+5

：B

：1671-8194（2014）31-0001-02

江蘇省教育廳資助項目（14KJB310023）

*通訊作者:E-mail: tangrenxian-t@163.com