劉田田，蔣 向，許曉東

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

桿狀病毒是一類主要感染節(jié)肢動(dòng)物的病毒，其宿主通常為鱗翅目昆蟲，此外還有膜翅目和雙翅目昆蟲[1]。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedro virus,AcMNPV)是桿狀病毒科的模式種，其基因組長(zhǎng)134 kb，共有154個(gè)開放閱讀框。AcMNPV的基因表達(dá)為級(jí)聯(lián)式調(diào)控，按基因表達(dá)時(shí)序可分為4個(gè)階段：立即早期基因表達(dá)、早期基因表達(dá)、晚期基因表達(dá)和極晚期基因表達(dá)。

早期基因的上游序列是昆蟲細(xì)胞的調(diào)節(jié)序列，其啟動(dòng)子可以被宿主細(xì)胞的RNA聚合酶Ⅱ及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子所識(shí)別，表達(dá)產(chǎn)物可滿足完成病毒復(fù)制所需的條件。病毒DNA復(fù)制是晚期基因轉(zhuǎn)錄的先決條件，晚期基因的表達(dá)依賴于早期基因及其產(chǎn)物，并通過病毒自身編碼的RNA聚合酶催化晚期基因的轉(zhuǎn)錄；此外，晚期基因的表達(dá)還需要一類蛋白因子調(diào)控，即晚期表達(dá)因子(Late expression factor,lef)。

瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)證明，AcMNPV中與病毒DNA復(fù)制相關(guān)的基因有：DNA引物酶lef-1[2]、DNA引物酶輔助因子lef-2(也是病毒蛋白組分)[3]、單鏈DNA結(jié)合蛋白lef-3[4-5]、DNA聚合酶dnapol[6]、反式激活因子ie1[7]、DNA復(fù)制輔助因子lef-7[8]、轉(zhuǎn)錄激活因子ie2(ien)[9]、DNA解旋酶p143[5]和抗細(xì)胞凋亡基因p35[10]。在已知功能的10個(gè)晚期表達(dá)因子中，有4個(gè)編碼RNA聚合酶的亞基：lef-4、lef-8、lef-9和p47[11]；而另外6個(gè)晚期表達(dá)因子為：lef-5(為轉(zhuǎn)錄起始因子而非延伸因子)[12]、lef-6(可以加速侵染循環(huán))[13]、lef-10、lef-11(是DNA復(fù)制所必需的)[14]、lef-12(可以刺激晚期因子的表達(dá))[15]和pp31(可以增強(qiáng)大多數(shù)病毒的轉(zhuǎn)錄水平)[16]。

體外晚期基因瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)表明，有19個(gè)AcMNPV基因被確定為晚期表達(dá)因子[17-18]。而在這19個(gè)晚期表達(dá)因子中，目前關(guān)于lef-10的功能知之甚少。lef-10基因全長(zhǎng)234 bp,編碼78個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為8.7 ku，是已知的相對(duì)分子質(zhì)量最小的晚期表達(dá)因子。

本研究以AcMNPV全基因組為模板，分別構(gòu)建包含lef-10、innateP-lef10和GFP融合基因的表達(dá)載體，感染草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9細(xì)胞，對(duì)其編碼產(chǎn)物進(jìn)行亞細(xì)胞定位及時(shí)空表達(dá)分析，以期為進(jìn)一步研究lef-10基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞

大腸桿菌Top10細(xì)胞、BL21(DE3)細(xì)胞、載體pTriEx-SP-GFP、Sf9細(xì)胞和pAc-GFP，皆由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；AcMNPV Bacmid來源于University of Reading,Prof. Ian Jones實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

PCR產(chǎn)物純化試劑盒、凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，均購自上海生工生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶BspHⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ和XbaⅠ及T4 DNA連接酶、Unstained Protein MW Marker，均購自Fermentas公司；酵母浸粉和蛋白胨均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；DNA Marker、抗GFP標(biāo)簽兔單克隆抗體、FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體，均購自康為世紀(jì)生物公司；Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑、碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)，均購自Roche公司；胎牛血清，購自Thermo Scientific HyClone公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參照AcMNPV基因組全序列[19]，構(gòu)建lef-10及innateP-lef10基因重組質(zhì)粒，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物(表1)。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 lef-10及innateP-lef10基因重組質(zhì)粒構(gòu)建所用引物

1.4 lef-10及innateP-lef10基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1lef-10及innateP-lef10基因的PCR擴(kuò)增 以AcMNPV基因組DNA為模板，用引物Ac-lef-10-F/Ac-lef-10-R、Ac-innateP-lef-10-F/Ac-lef-10-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：AcMNPV基因組100 ng，25 mmol/L MgCl22 μL，10×TaqBuffer 2 μL，25 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 μmol/L上游引物Ac-lef-10-F/Ac-innateP-lef-10-F 1 μL，10 μmol/L下游引物Ac-lef-10-R 1 μL，Taq酶 0.2 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s(lef-10)/2 min(innateP-lef10)，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min,最后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，-20 ℃保存。

1.4.2 pTriEx-lef10-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BspHⅠ和BamHⅠ對(duì)上述PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，與以NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切pTriEx-SP-GFP質(zhì)粒切膠回收的載體用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，然后按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素(50 μg/mL)抗性平板，培養(yǎng)過夜后挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定，將陽性菌落接種至含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min過夜搖菌，用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行XbaⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定，將鑒定為陽性克隆的重組質(zhì)粒送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序，構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒命名為pTriEx-lef10-GFP。

1.4.3AcMNPVlef-10天然啟動(dòng)子的確定 根據(jù)桿狀病毒早期基因核心啟動(dòng)子元件的保守基序，即TATA元件、起始子基元序列(INR)ATCA(G/T)T(C/T)、下游活化區(qū)元件(DAR)(A/T)CACNG及遠(yuǎn)側(cè)上游活化區(qū)元件(UAR)A(A/T)CGT(G/T)，找到了位于lef-10上游近1 676 bp處的啟動(dòng)子元件(圖1)。

另外，在AcMNPV全基因組序列中，lef-10與下游基因vp1054有141 bp重疊，且位于vp1054上游523 bp處有3個(gè)TAAG基序[20]，而TAAG基序?yàn)橥砥谂c極晚期基因啟動(dòng)子的重要元件。

圖1 lef-10和vp1054順式作用啟動(dòng)子元件

引物Ac-innateP-lef-10-F就是根據(jù)桿狀病毒早期基因核心啟動(dòng)子元件的保守基序設(shè)計(jì)的，用引物Ac-innateP-lef-10-F和Ac-lef-10-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的片段包含了lef-10啟動(dòng)子和編碼區(qū)的全部序列。

1.4.4 pTriEx-innateP-lef10-GFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將innateP-lef10 PCR產(chǎn)物及構(gòu)建好的pTriEx-lef10-GFP質(zhì)粒均進(jìn)行XbaⅠ、BamHⅠ雙酶切，產(chǎn)物回收，將酶切好的PCR產(chǎn)物片段與切膠回收的載體大片段進(jìn)行連接，16 ℃過夜連接，其余操作方法同1.4.2。將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒命名為pTriEx-innateP-lef10-GFP。

1.5 lef-10在Sf9細(xì)胞中的時(shí)空表達(dá)及定位

1.5.1lef-10在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)定位分析 將構(gòu)建好的pTriEx-lef10-GFP與Bacmid共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組病毒。轉(zhuǎn)染步驟為：取0.5 mL離心管，向其中加入100 μL無菌水、5 μL構(gòu)建好的質(zhì)粒和3 μL線性化Bacmid，混勻后加入5 μL轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻，靜置10～30 min后均勻加入到鋪好的Sf9細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染4 d后收集上清病毒，然后取100 μL病毒重新感染Sf9細(xì)胞，3 d后，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.5.2 天然啟動(dòng)子控制下的lef-10在Sf9細(xì)胞中的時(shí)空定位分析 將構(gòu)建好的pTriEx-innateP-lef10-GFP與Bacmid共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。轉(zhuǎn)染步驟同1.5.1。轉(zhuǎn)染4 d后，收集上清病毒用于后續(xù)試驗(yàn)。將Sf9細(xì)胞鋪于6孔板平皿中，每孔感染100 μL重組病毒，感染4，8，16，24和36 h后收集細(xì)胞，經(jīng)固定、抗體孵育及碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色。操作步驟如下：收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，200g離心15 min,棄上清；PBS洗3次，每次5 min，200g離心5 min，棄上清；質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，200g離心5 min，棄上清；PBS洗2次，200g離心5 min，棄上清；用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的PBS封閉30 min，200g離心5 min，棄上清；一抗37 ℃孵育2 h，200g離心5 min,棄上清；PBS洗3次，每次5 min，200g離心5 min，棄上清；二抗37 ℃黑暗孵育1 h，200g離心5 min，棄上清；PBS洗3次，每次5 min，200g離心5 min，棄上清；向細(xì)胞中加入PI(20 μg/mL)。取一干凈載玻片，在其上滴1滴處理好的細(xì)胞懸浮液，蓋上蓋玻片，倒置，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 lef-10 PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pTriEx-lef10-GFP的雙酶切鑒定

以AcMNPV基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增lef-10基因，得到234 bp的特異性片段，大小與預(yù)期結(jié)果吻合(圖2-A)。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTriEx-lef10-GFP經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切后，得到約533 bp的片段(圖2-B)，與預(yù)期片段大小相同，表明載體構(gòu)建正確。

2.2 innateP-lef10 PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pTriEx-innateP-lef10-GFP的雙酶切鑒定

以AcMNPV基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增innateP-lef-10基因，得到2 182 bp的特異性片段，大小與預(yù)期結(jié)果吻合(圖3-A)。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTriEx-innateP-lef10-GFP經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切后，得到約2 204 bp的片段(圖3-B)，與預(yù)期片段大小相同，表明載體構(gòu)建正確。

圖2 lef-10基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果(A)及重組質(zhì)粒pTriEx-lef10-GFP的雙酶切鑒定(B)

2.3 AcMNPV lef-10在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)定位

由圖4可見，在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光蛋白，由于lef-10和GFP形成的融合蛋白在強(qiáng)晚期啟動(dòng)子p10下共表達(dá)，所以觀察到的綠色部分為lef-10和GFP形成的融合蛋白。從圖4可以看到，在重組病毒感染Sf9細(xì)胞的晚期，表達(dá)的lef-10蛋白主要定位于細(xì)胞核，初步確定了其在宿主細(xì)胞內(nèi)的定位情況。

圖4 AcMNPV lef-10在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)定位

2.4 天然啟動(dòng)子控制下的lef-10在Sf9細(xì)胞中的時(shí)空表達(dá)定位

為了進(jìn)一步確定lef-10在Sf9細(xì)胞中的時(shí)空表達(dá)情況，本試驗(yàn)對(duì)天然啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的lef-10進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)定位分析。在激光共聚焦顯微鏡下觀察的結(jié)果(圖5)顯示，在重組病毒感染Sf9細(xì)胞的早期，即感染4 h，與GFP融合的lef-10已開始表達(dá)，但表達(dá)量較低；在向晚期時(shí)相過渡時(shí)期(即感染8 h后)，lef-10表達(dá)量增加并逐漸向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，在晚期和極晚期時(shí)相，蛋白成簇聚集在細(xì)胞核中。據(jù)此推測(cè)，在病毒感染宿主細(xì)胞晚期，lef-10作為晚期表達(dá)因子在細(xì)胞核中發(fā)揮一定的功能，用于調(diào)控其他基因的轉(zhuǎn)錄；同時(shí)，也進(jìn)一步證明試驗(yàn)早期核心啟動(dòng)子元件能夠啟動(dòng)lef-10的早期表達(dá)。

圖5 天然啟動(dòng)子控制下的lef-10在Sf9細(xì)胞中的時(shí)空表達(dá)及定位

3 討 論

先前研究表明，無論在原核表達(dá)系統(tǒng)還是昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，lef-10都會(huì)形成一個(gè)巨大的復(fù)合物[21]。但由于得不到lef-10單體蛋白而無法獲得抗lef-10的抗體，而GFP可以作為融合標(biāo)簽用于蛋白的亞細(xì)胞定位[22]，所以本試驗(yàn)將融合了GFP的lef-10蛋白用于亞細(xì)胞定位分析。

由于目前沒有關(guān)于AcMNPVlef-10及其啟動(dòng)子的報(bào)道，為了盡量保留其啟動(dòng)子及有關(guān)旁側(cè)序列，本試驗(yàn)在找到的核心啟動(dòng)子元件上游延伸了近180 bp，從而使lef-10能夠得到完整表達(dá)。

在AcMNPV基因組中，polh基因表達(dá)的蛋白是形成病毒包涵體的主要蛋白，它對(duì)感染性病毒的產(chǎn)生及復(fù)制是非必需的[23]，所以在桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)中，polh基因可以作為外源基因的插入位點(diǎn)。本試驗(yàn)構(gòu)建的pTriEx-lef10-GFP和pTriEx-innateP-lef10-GFP載體可以與Bacmid發(fā)生重組，形成可以表達(dá)外源基因的重組病毒。

載體pTriEx-SP-GFP包含了可以在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞及動(dòng)物細(xì)胞中啟動(dòng)基因表達(dá)的3類啟動(dòng)子。本研究結(jié)果顯示，pTriEx-lef10-GFP與Bacmid共感染Sf9細(xì)胞后，lef-10可以在載體自帶的晚期強(qiáng)啟動(dòng)子p10的啟動(dòng)下進(jìn)行表達(dá)；感染晚期，lef-10表達(dá)量較大且主要集中于細(xì)胞核中。

本試驗(yàn)分析了天然狀態(tài)下的lef-10在宿主細(xì)胞中的表達(dá)定位情況，結(jié)果顯示，在病毒感染細(xì)胞早期，lef-10就已開始表達(dá)，隨著感染時(shí)間的推移，lef-10逐漸向細(xì)胞核移動(dòng)，在晚期和極晚期時(shí)相，蛋白成簇聚集在細(xì)胞核中。這些結(jié)果也進(jìn)一步說明，在受染細(xì)胞核中，lef-10是作為晚期表達(dá)因子發(fā)揮功能的，并且對(duì)其他基因的轉(zhuǎn)錄起一定的調(diào)控作用。

Lin等[24]和Durantel等[25]在研究AcMNPVlef-11和lef-4基因的表達(dá)及亞細(xì)胞定位時(shí)，利用anti-LEF-11和anti-LEF-4多克隆抗體，分析了在受感染細(xì)胞Sf9中l(wèi)ef-11和lef-4的表達(dá)水平及其在細(xì)胞中的定位，結(jié)果顯示：lef-11和lef-4在病毒感染Sf9細(xì)胞的早期時(shí)相開始表達(dá)，且在晚期時(shí)相均定位在細(xì)胞核中，這與它們作為晚期表達(dá)因子行使功能是一致的；同時(shí)，2位學(xué)者還通過5′RACE、3′RACE及RT-PCR對(duì)它們的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了進(jìn)一步分析。而在本試驗(yàn)中，由于抗體的限制，AcMNPV在感染Sf9細(xì)胞后,無法通過Western-blot方法對(duì)lef-10蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析,后續(xù)試驗(yàn)將在轉(zhuǎn)錄水平上通過對(duì)lef-10轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，從而對(duì)lef-10的表達(dá)水平進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究采用構(gòu)建GFP融合標(biāo)簽的方法分析了lef-10在天然啟動(dòng)子控制下的表達(dá)及亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果顯示：lef-10在感染宿主細(xì)胞早期已開始表達(dá)，在晚期和極晚期時(shí)相，主要集中于細(xì)胞核中，推測(cè)lef-10對(duì)晚期其他基因的轉(zhuǎn)錄具有一定的調(diào)控作用。這為進(jìn)一步研究lef-10的功能提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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