李俊營，詹 凱，畢善輝，劉 偉，韓 濤，李紹全

(1 安徽省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031；2 安徽農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，安徽 合肥 230036；3 安徽皖西麻黃雞禽業(yè)有限公司，安徽 六安 237400)

蛋品質(zhì)是禽蛋生產(chǎn)中的一個重要經(jīng)濟性狀，良好的蛋殼品質(zhì)有助于減少因蛋殼破損造成的經(jīng)濟損失。因此，在蛋雞育種中如何提高蛋品質(zhì)受到相關(guān)研究人員的關(guān)注。近年來，隨著雞基因組測序圖譜、SNP草圖及功能解析的不斷完善，利用功能基因組學研究的技術(shù)和方法，發(fā)掘和利用影響蛋品質(zhì)候選基因中的有效分子標記，是提高蛋品質(zhì)的重要途徑之一。

Ovocalyxin-32(OCX-32)是一種蛋殼基質(zhì)蛋白，由輸卵管末端上皮細胞分泌到子宮液中，在蛋殼形成的終止階段其表達量逐漸增加[1-2]，導致碳酸鈣沉降的時間逐漸延長[3-4]，可能具有終止鈣化的功能[5]。OCX-32由275個氨基酸(AA)組成[6]，主要分布在蛋殼的表層(即角質(zhì)層)，蛋殼角質(zhì)層與外界環(huán)境中的病原微生物直接接觸，是雞蛋防御外界微生物侵襲的第一道屏障[7-8]，具有抗菌作用。有研究表明，編碼OCX-32蛋白的基因?qū)Φ皻て焚|(zhì)和產(chǎn)蛋量具有顯著影響[9-12]。Dunn等[10]發(fā)現(xiàn)，OCX-32基因的一個內(nèi)含子單核苷酸多態(tài)性(SNP)與雞蛋乳突層厚度顯著相關(guān)；Uemoto等[11]發(fā)現(xiàn)，OCX-32基因與產(chǎn)蛋率顯著相關(guān)。蛋雞產(chǎn)蛋性能影響著OCX-32基因的表達，低產(chǎn)蛋性能蛋雞的OCX-32表達量較高，高產(chǎn)蛋性能蛋雞反而表達量較低，這表明OCX-32基因是影響產(chǎn)蛋率的一個候選基因[13]。

目前，有關(guān)OCX-32基因?qū)Φ半u生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)影響的研究相對較少，其在我國地方家禽品種淮南麻黃雞中的遺傳多樣性尚未見報道，而且淮南麻黃雞生產(chǎn)中存在產(chǎn)蛋率低和蛋質(zhì)量小等問題。本試驗研究了安徽省4個地方雞品種中OCX-32基因外顯子4的遺傳多態(tài)性，并分析了外顯子4的多態(tài)性與淮南麻黃雞蛋品質(zhì)之間的相關(guān)性，旨在探尋與淮南麻黃雞蛋品質(zhì)密切相關(guān)的遺傳標記位點，為淮南麻黃雞的選育提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

皖南三黃雞來源于安徽省池州市青陽縣畜牧獸醫(yī)站皖南三黃雞原種場，樣本量為60只；五華雞來源于安徽省蕪湖市繁昌縣蕪湖鐘氏禽業(yè)有限公司，樣本量為120只；淮北麻雞來源于安徽省宿州市興強養(yǎng)禽專業(yè)合作社，樣本量為60只；淮南麻黃雞來源于安徽省六安市安徽皖西麻黃雞禽業(yè)有限公司，樣本量為308只。其中淮南麻黃雞于18周齡時轉(zhuǎn)入產(chǎn)蛋舍個體籠飼養(yǎng)，記錄開產(chǎn)蛋質(zhì)量，在30周齡時連續(xù)5天測定308只雞所產(chǎn)雞蛋的質(zhì)量、蛋形指數(shù)、蛋殼厚度和蛋殼強度等蛋品質(zhì)指標，參照文獻[14]的方法進行蛋品質(zhì)測定。

1.2 主要試劑

蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL 2000 DNA Marker、瓊脂糖、DNA片段回收試劑盒等均購于寶生物工程(大連)有限公司，酚、氯仿等試劑購于上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司。根據(jù)GenBank上公布的OCX-32基因序列(GenBank登錄號：NM_204534和AADN02021077.1)，用Primer 5.0軟件設(shè)計1對引物(上游：5′-TGTTTCTGATGAAGAGCCAGA-3′，下游：5′-CTTTGCCAC-TCTGTAGGCTGT-3′)，用于OCX-32基因第4外顯子擴增[11]。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.3 雞基因組DNA的提取

試驗雞翅靜脈采集血樣1.5 mL/只，ACD抗凝，低溫帶回實驗室后于-80 ℃保存。采用苯酚/氯仿法提取雞血液基因組DNA，用TE溶液將DNA樣品稀釋成50 ng/μL的溶液備用。

1.4 OCX-32基因外顯子4的PCR擴增及PCR-NcoⅠ-RFLP酶切

1.4.1 PCR擴增 PCR反應體系總體積為20 μL，其中含有10×PCR buffer(不含Mg2+)2.0 μL，20 mmol/L MgCl21.5 μL，10 mmol/μL 4×dNTPs Mix 0.4 μL，10 pmol/L上下游引物各1.0 μL，5 U/μLTaqDNA 聚合酶0.25 μL和50 ng/μL DNA模板 1.0 μL，加滅菌雙蒸水至20 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.2 PCR-NcoⅠ-RFLP 酶切體系為：3 μL PCR產(chǎn)物、10 U/L的限制性內(nèi)切酶NcoⅠ 0.1 μL、10×buffer 1.5 μL，加滅菌雙蒸水至15 μL，混勻后于37 ℃恒溫水浴鍋中酶切過夜，次日用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，Alpha Innotech凝膠成像系統(tǒng)照相分析。根據(jù)特征條帶類型判定基因型。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用軟件POPGEN(Version 1.31)計算基因型頻率、等位基因頻率、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)。對數(shù)據(jù)進行卡方檢驗，參考文獻[15]的方法檢驗Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

考慮到試驗雞群遺傳背景一致，飼養(yǎng)管理相同，構(gòu)建如下一般線性模型：Yijk=μ+Gj+eijk。式中：Yijk表示各個體性狀測定值，μ表示群體均值，Gj表示基因型效應，eijk表示隨機誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 OCX-32外顯子4的PCR擴增及PCR-NcoⅠ-RFLP酶切分析

OCX-32基因第4外顯子在4個地方雞品種中的擴增產(chǎn)物均為1條250 bp的特異性條帶，其中五華雞的擴增結(jié)果見圖1。該片段經(jīng)PCR-NcoⅠ-RFLP檢測，發(fā)現(xiàn)在494位核苷酸處存在A→C突變，表現(xiàn)為3種基因型(圖2)：AA(250 bp)、AC(250 bp+194 bp+56 bp)和CC(194 bp+56 bp)，其中五華雞的酶切結(jié)果見圖2。

圖1 五華雞OCX-32基因外顯子4的擴增結(jié)果

2.2 不同品種雞OCX-32基因外顯子4的遺傳多態(tài)性分析

4個地方雞品種OCX-32外顯子4的基因型和等位基因頻率、雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)等指標的計算結(jié)果見表1。

表1 4個品種雞OCX-32基因外顯子4 A494C位點的遺傳多態(tài)性分析

由表1可知，在4個地方雞品種中，AC基因型所占比例均較高，所檢測樣本群體均處于中度多態(tài)；卡方檢驗結(jié)果表明，4個群體在A494C位點都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

2.3 OCX-32基因外顯子4基因型與淮南麻黃雞蛋品質(zhì)的相關(guān)性分析

由表2可知，不同基因型對淮南麻黃雞蛋形指數(shù)、蛋殼厚度、蛋殼強度、蛋黃色澤和蛋黃比率均無顯著影響(P>0.05)；但對開產(chǎn)蛋質(zhì)量、30周齡蛋質(zhì)量、蛋白高度和哈氏單位影響顯著(P<0.05)。CC基因型的開產(chǎn)蛋質(zhì)量和30周齡蛋質(zhì)量比AA基因型分別高5.93%和2.91%(P<0.05)；AA和CC基因型的蛋白高度比AC基因型分別高5.96%和4.51%(P<0.05)；AA基因型的哈氏單位比AC基因型高2.35%(P<0.05)。

表2 淮南麻黃雞OCX-32基因外顯子4 A494C位點不同基因型與其蛋品質(zhì)的相關(guān)性分析

3 討 論

OCX-32是殼腺分泌的一種基質(zhì)蛋白，因具有抗菌和可能終止蛋殼鈣化的功能而備受研究人員的關(guān)注[16-17]。Takahashi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，雞9號染色體上具有影響蛋品質(zhì)性狀的數(shù)量性狀基因座(QTL)，并建議將OCX-32基因作為影響蛋品質(zhì)性狀的候選基因。OCX-32基因位于雞9號染色體上，包括6個外顯子和5個內(nèi)含子[6]，外顯子1上存在rs16680302和rs16680303 2個突變位點[11]，外顯子2-6上發(fā)現(xiàn)28個SNPs和1個堿基缺失[19]。本試驗發(fā)現(xiàn)，OCX-32基因外顯子4第494位點存在A→C的突變，安徽省4個地方雞品種試驗群體在A494C位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，4個地方雞品種群體均表現(xiàn)為中度多態(tài)，遺傳多樣性都比較豐富。這可能是由于4個家禽品種都是安徽省的地方品種，經(jīng)過長期的進化與選擇，在所處的生態(tài)環(huán)境條件下，形成了適應環(huán)境的遺傳特性。

有研究表明，OCX-32基因?qū)﹄u蛋的蛋品質(zhì)(蛋殼顏色、蛋白高度、蛋質(zhì)量、蛋黃質(zhì)量、雞蛋縱徑長度和雞蛋橫徑長度等)[9,19]和產(chǎn)蛋率[11]有顯著影響。本試驗表明，OCX-32基因外顯子4的A494C位點基因多態(tài)性與淮南麻黃雞開產(chǎn)蛋質(zhì)量、30周齡蛋質(zhì)量、蛋白高度和哈氏單位顯著相關(guān)(P<0.05)。CC基因型的開產(chǎn)蛋質(zhì)量和30周齡蛋質(zhì)量顯著高于AA基因型；AA和CC基因型的蛋白高度顯著高于AC基因型；AA基因型的哈氏單位顯著高于AC基因型(P<0.05)。針對淮南麻黃雞生產(chǎn)中蛋質(zhì)量小的缺點，C等位基因型的選擇有利于提高淮南麻黃雞的蛋質(zhì)量。但由于試驗群體樣本量的限制，C等位基因是否可以作為提高蛋質(zhì)量的有利基因，還有待于進一步研究。

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