譚慧，王冰冰，盧徐漣，侯柏龍，林曉云，劉巧瓊，張麗芳，陳筱菲

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 分子病毒與免疫研究所/微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室， 浙江 溫州 325035）

M13K07輔助噬菌體進行兔免疫制備了M13噬菌體多克隆抗體，為噬菌體展示技術(shù)研究提供檢測抗體。

M13噬菌體多克隆抗體的制備與鑒定

譚慧1，王冰冰2，盧徐漣2，侯柏龍2，林曉云2，劉巧瓊2，張麗芳2，陳筱菲1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 分子病毒與免疫研究所/微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室， 浙江 溫州 325035）

目的：制備M13K07輔助噬菌體多克隆抗體。方法：將M13K07輔助噬菌體進行大量擴增，以此作為免疫原于1、3、5周進行兔免疫，收集0周和免疫后2、4、6、8周免疫血清，用間接ELISA法對兔免疫血清的效價進行檢測，進一步用免疫斑點實驗檢測兔多克隆抗體與M13K07輔助噬菌體的特異性結(jié)合能力。結(jié)果：M13K07輔助噬菌體免疫兔可產(chǎn)生高效價的多克隆抗體，效價達1:3 200，并能特異性識別M13K07輔助噬菌體。結(jié)論：成功制備了高效價的M13K07輔助噬菌體多克隆抗體，為噬菌體展示技術(shù)研究提供了檢測抗體。

M13K07輔助噬菌體；多克隆抗體；免疫斑點實驗；酶聯(lián)免疫吸附試驗；兔

噬菌體展示技術(shù)是將外源基因表達產(chǎn)物與噬菌體衣殼蛋白融合，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時將其遺傳密碼信息整合到噬菌體的基因組中，在此過程中，輔助噬菌體對噬菌粒的復(fù)制和

組裝發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，只有在輔助噬菌體的協(xié)助下，噬菌體才能完成單鏈DNA復(fù)制[1-2]。M13K07是M13噬菌體的一個突變體，為最常用的輔助噬菌體，帶有一個質(zhì)粒復(fù)制起始點、卡那霉素抗性基因以及G6125T的突變基因I I[3]，其抗體被廣泛應(yīng)用于噬菌體展示技術(shù)中篩選結(jié)果的檢測。盡管M13K07輔助噬菌體單克隆抗體已商品化，但單抗僅針對一個抗原表位且價格十分昂貴，因而有一定的應(yīng)用局限性。侯曉紅等[4]利用沙眼衣原體進行兔免疫成功制備了高效價的多克隆抗體?；谏鲜觯狙芯坑?/p>

M13K07輔助噬菌體進行兔免疫制備了M13噬菌體多克隆抗體，為噬菌體展示技術(shù)研究提供檢測抗體。

1 材料和方法

1.1 材料輔助噬菌體M13K07由溫州醫(yī)科大學(xué)分子病毒與免疫實驗室購買保存；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔HRP-IgG購自中國杭州格朗瑞生物科技有限公司；新西蘭大白兔由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體質(zhì)量1.5 kg，雌性；弗氏佐劑購自美國Sigma公司；ECL發(fā)光劑購自中國北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 M13 K07輔助噬菌體擴增：將輔助噬菌體M13K07感染對數(shù)生長期的大腸桿菌TG1（E.coliTG1），于37 ℃，200 r/min搖床中振搖孵育30 min后，加入預(yù)熱至50 ℃融化的頂層瓊脂，混勻后立即轉(zhuǎn)入37 ℃預(yù)熱的2YT平板，鋪勻，室溫放置5 min，37 ℃培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)板上的單個噬菌斑接種到3～4 mL TG1的菌液中，37 ℃，200 r/min搖床中震蕩孵育2 h，轉(zhuǎn)至500 mL 2YT培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)1 h，加入50μg/mL卡那霉素繼續(xù)振蕩培養(yǎng)16 h，5 000 r/min，4 ℃離心15 min收集上清，經(jīng)PEG/NaCl沉析1 h。于4 ℃，10 000 r/min離心15 min，棄上清，將沉淀溶于2YT緩沖液，經(jīng)0.45μm膜過濾即為M13K07輔助噬菌體，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 M13 K07輔助噬菌體滴度的測定：將M13K07輔助噬菌體作梯度稀釋（101，102，103，…………1012），各取100μ L M13K07輔助噬菌體與500μL對數(shù)生長期的E.coliTG1混勻，加入含2YT頂層瓊脂并平鋪于預(yù)熱的2YT培養(yǎng)平板，37 ℃，200 r/min搖床孵育20 min，室溫放置5 min后，37 ℃培養(yǎng)過夜。計數(shù)平板上的空斑數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即為噬菌體的滴度。

1.2.3 兔抗M13K07輔助噬菌體免疫血清的制備：6只新西蘭大白兔隨機分為兩組：3只為M13K07輔助噬菌體免疫組，將M13K07輔助噬菌體與等體積弗氏佐劑混勻，以1×1010/只背部皮下多點注射大白兔；另3只背部皮下多點注射等體積PBS，作為陰性對照組。分別于1、3、5周免疫，并于0、2、4、6、8周通過兔耳緣靜脈取血，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 免疫斑點實驗檢測M13K07輔助噬菌體多克隆抗體的特異性：取2 μL滅活的1×1010M13K07輔助噬菌體點于硝酸纖維素膜上，置于37 ℃溫箱中30 min，用5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，PBST洗滌，加入1:1 000稀釋的第6周免疫兔血清，用PBST洗滌3次，加1:5 000稀釋HRP-山羊抗兔IgG，37 ℃作用2 h，經(jīng)吐溫-20磷酸緩沖液（PBST）洗滌后加入ECL發(fā)光劑顯色5 min，壓片曝光。

1.2.5 間接ELISA法檢測M13K07輔助噬菌體多克隆抗體的效價：滅活的1×1010/mL M13K07輔助噬菌體包被96孔酶標(biāo)板，100μ L/孔，4 ℃過夜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，分別加入1:100稀釋的0、2、4、6、8周免疫血清，37 ℃作用1 h，經(jīng)PBST洗滌，加1:6 000稀釋的HRP-山羊抗兔IgG，37 ℃作用1.5 h，洗滌后加HRP-OPD顯色液顯色30 min后，加入終止液（2%稀硫酸）終止反應(yīng)，測定波長450 nm吸收值。同時，將第6周的免疫兔血清進行倍比稀釋（免疫血清分別以1:100、1:200、1:400、1:800、1:1 600、1:3 200、1:6 400和1:12 800的倍比稀釋），用ELISA檢測方法（步驟同上）進行滴度檢測，以分析兔多克隆抗體的效價。

2 結(jié)果

2.1 M13 K07 輔助噬菌體的擴增及滴度鑒定結(jié)果輔助噬菌體M13K07擴增后，在平板上可觀察到菌斑（透亮的斑點）（見圖1A），通過計數(shù)平板上的菌斑數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，結(jié)果顯示噬菌體的滴度為1.7× 1014。不加M13K07輔助噬菌體的細(xì)菌培養(yǎng)平板沒有觀察到菌斑（見圖1B）。

圖1 M13K07輔助噬菌體在2YT平板上的單克隆菌斑

2.2 免疫斑點雜交檢測M13K07輔助噬菌體免疫兔血清抗體特異性結(jié)果第6周免疫兔血清以1:1 000稀釋作為一抗與M13K07輔助噬菌體進行免疫斑點夾雜檢測，結(jié)果顯示免疫血清能特異識別M13K07輔助噬菌體，出現(xiàn)陽性反應(yīng)斑點（見圖2A），而免疫前血清則未出現(xiàn)陽性反應(yīng)斑點（見圖2B），同時商品化M13單抗作為陽性對照與M13K07輔助噬菌體進行了免疫斑點雜交實驗，可見陽性反應(yīng)斑點（見圖2C）。

2.3 M13 K07 輔助噬菌體多克隆抗體反應(yīng)及效價的測定用M13K07輔助噬菌體作為包被抗原，檢測多克隆兔血清抗體的效價，其檢測數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，M13K07輔助噬菌體免疫組兔于免疫后第2周開始產(chǎn)生特異性IgG，至第6周達到高峰（見圖3A），多克隆抗體血清的效價可達1:3 200（見圖3B）。

圖2 免疫斑點實驗檢測M13K07輔助噬菌體免疫血清抗體的特異性結(jié)果

圖3 M13K07輔助噬菌體多克隆血清抗體效價的ELISA檢測結(jié)果

3 討論

噬菌體展示技術(shù)自1985年由Smith[5]發(fā)明以來，由于其鮮明的技術(shù)優(yōu)勢并經(jīng)不斷發(fā)展與完善，目前已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域[6-10]，如抗體工程、抗原表位研究、新藥研發(fā)、疾病診斷、疫苗研究及腫瘤治療等。該技術(shù)將外源多肽或蛋白質(zhì)與噬菌體衣殼蛋白融合，并在其表面展示，再根據(jù)其配體的特異性親和力，將所需的多肽或蛋白質(zhì)篩選出來，其原理為肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)一定時間孵育后，游離噬菌體經(jīng)洗滌除去，與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體再以競爭受體或酸洗脫下，洗脫下的噬菌體用以感染宿主細(xì)胞并經(jīng)繁殖擴增后，進行下一輪洗脫，經(jīng)過3～5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集[11-12]，使靶蛋白得以篩選。由于ELISA技術(shù)是較敏感和簡單的篩選方法，且該方法相較于其他篩選檢測方法更能直接的反映多肽親和力和特異性[13]，因此ELISA技術(shù)成為噬菌體展示篩選的最常用方法，而ELISA檢測方法中，M13噬菌體抗體是必不可少的試劑，雖然目前市場不乏商品化的M13噬菌體單抗，但價格昂貴且僅針對一個抗原表位有其應(yīng)用的局限性。

本研究用M13K07輔助噬菌體進行大量擴增，以此作為免疫原對新西蘭大白兔進行免疫，成功制備了可特異性識別M13K07輔助噬菌體的較高效價的多克隆抗體。噬菌斑實驗結(jié)果表明：噬菌斑的成功制備，使得M13K07輔助噬菌體的濃度和滴度得以準(zhǔn)確計算，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。ELISA檢測數(shù)據(jù)顯示：M13K07輔助噬菌體具有較強的免疫原性，于免疫第2周開始產(chǎn)生特異性抗體，免疫第6周血清抗體滴度達到最高值，免疫第8周血清抗體滴度開始下降，免疫第6周血清效價可達1:3 200。通過免疫斑點實驗證實了制備的兔多克隆抗體能與M13K07輔助噬菌體發(fā)生特異性結(jié)合，與商品化M13單抗結(jié)合M13K07輔助噬菌體特異性一致。本研究與先前任曉峰等[14]和胡巍等[15]報道的M13噬菌體多克隆抗體制備相比較，優(yōu)勢在于：用M13K07輔助噬菌體作為免疫原特異性更好，并用免疫斑點實驗對多克隆抗體與M13K07輔助噬菌體的特異性結(jié)合力進行了鑒定，證實了該多克隆抗體能特異識別M13噬菌體。

本研究成功制備了M13噬菌體多克隆抗體，為噬菌體展示技術(shù)研究提供了檢測抗體。利用免疫兔制備的多克隆抗體，具有制備簡單快速、來源方便、物美價廉等優(yōu)點，在噬菌體展示技術(shù)靶抗原的篩選和研究應(yīng)用方面具有較為廣泛的應(yīng)用前景。

[1]杜東霞, 張冉. 輔助噬菌體在噬菌體展示中的應(yīng)用及研究進展[J]. 微生物學(xué)通報, 2009, 36(2): 261-266.

[2]Soltes G, Hust M, Bansal A, et al. On the influence of vector design on antibody phage display[J]. Biotchnol, 2007, 127 (4): 626-637.

[3]Vieira J, Messing J. Production of single-stranded plasmid DNA[J]. Methods Enzymol, 1987, 15(3): 3-11.

[4]侯曉紅, 朱珊麗, 王樂丹. E血清型沙眼衣原體抗體的制備及檢測[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2007, 37(4): 344-346.

[5]Smith GP. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J]. Science, 1985, 228(4705): 1315-1317.

[6]Hayden MS, Gilliland LK, Ledbetter JA. Antibody engineering[J].Curropin Immunol, 1997(9): 201-212.

[7]Les ski GB, West rink J. Novel vaccine strategies to T-independent antigens[J]. J Microbiol Methods, 2001, 47(2): 135-149

[8]Kay BK, Kura kin AV. From peptides to drugs via phage display[J]. Drug DiscovToday, 1998(3): 370-378.

[9]Ren X, Wang M, Yin J. Phages harboring specific peptides that recognize the N protein of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus distinguish the virus from other viruses[J]. Clin Microbiol, 2010, 48(5): 1875-1881.

[10]Pini A,Bracci L. Phage display of antibody fragments[J]. Science, 2000, 1(2): 155-169.

[11]唐麗, 田海波, 李廣興, 等. 噬菌體展示技術(shù)原理及其在生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2009, 8(1): 23-24.

[12]Ren X, Liu B, Yin J, Li G. Phage displayed peptide recognizing porcine amino peptidase N inhibit transmissible enteritis corona virus infection in vitro[J]. Virology, 2011, 410 (2): 299-306.

[13]石娜, 李廣興, 任曉峰, 等. 豬IL-15與PRRS病毒GP5基因核酸疫苗免疫效力[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010, 41(1): 97-102.

[14]任曉峰, 馬曉微. M13噬菌體肽庫擴增及兔抗血清制備[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013, 44(3): 79-82.

[15]胡巍, 劉文, 宋曉國. 兔抗M13噬菌體酶標(biāo)抗體的制備[J]. 淄博學(xué)院學(xué)報, 2002, 4(4): 9-11.

（本文編輯：吳健敏）

Preparation and identification of polyclonal antibodies against M13 phage

TAN Hui1, WANG Bingbing2,LU Xulian2, HOU Bolong2, LIN Xiaoyun2, LIU Qiaoqiong2, ZHANG Lifang2, CHEN Xiaofei1.1.Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2. Department of Microboilogy Immunology/Institute of Molecular Virology and Immunology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective:To prepare and characterize rabbit-anti M13K07 helper phage polyclonal antibodies.Methods:The helper phage was amplified and used to immunize rabbits to obtain polyclonal antibodies. Begin from the first week, the same immunization schedule of subcutaneous multipoint injection was repeated three times at 2 weeks intervals. Begin from 0 week, take blood serum collection from ear vein every other week. The immunogenicity of the M13K07 helper phage was detected with Dot Immunobinding Assay and indirect ELISA was used to demonstrate the titer of antiserum in the immunized rabbit.Results:It showed that the specific rabbit antibody against M13K07 helper phage could combined with M13K07 with Dot Immunobinding Assay. Indirect ELISA analysis showed that the helper page can stimulate high levels specific IgG antibody. Along with the increase of immunization times, antibody levels keep rising, reached the peak at the 6th week. The titer of the polyclonal antibody was approximately1:3 200. Conclusion: In this study, polyclonal antibodies against this M13K07 helper phage is successfully generated and such helper phage polyclonal antibodies is important reagent for functional analysis for phage.

M13K07 helper phage; polyclonal antibodies; dot immunobinding assay; ELISA; rabbit

R373.9

A

1000-2138（2014）04-0245-04

2013-10-23

國家自然科學(xué)基金資助項目（81172463）。

譚慧（1986-），女，湖北利川人，碩士生。

陳筱菲，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：13706692998@ 163.com。