劉云霄，潘曉瓊，胡臻

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 中醫(yī)科，浙江 溫州 325027）

二氫楊梅素對(duì)H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的影響

劉云霄，潘曉瓊，胡臻

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 中醫(yī)科，浙江 溫州 325027）

目的：研究二氫楊梅素（DMY）對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）損傷的影響并探討其作用機(jī)制。方法：用不同濃度DMY（5μ g·mL-1，20μ g·mL-1，80μ g·mL-1）預(yù)處理保護(hù)HUVECs 12 h，再用0.5 mmol·L-1H2O2干預(yù)12 h，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力；用Hoechst33258進(jìn)行細(xì)胞核染色；并取上清液檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量；用流式細(xì)胞儀分別測(cè)活性氧（ROS）和細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量。結(jié)果：DMY能明顯提高H2O2（0.5 mmol·L-1）損傷后HUVECs存活率（P＜0.05），增加上清液SOD活性，降低MDA含量，減少細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，其中DMY 5 μg·mL-1時(shí)效果最明顯。結(jié)論：DMY對(duì)H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與清除細(xì)胞內(nèi)ROS，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)，濃度以DMY 5 μg·mL-1時(shí)效果最明顯。

二氫楊梅素；內(nèi)皮細(xì)胞；超氧化物歧化酶；丙二醛；活性氧；細(xì)胞內(nèi)鈣離子

藤茶作為一種民間古茶，可追溯至東晉時(shí)期[1]。目前，在我國(guó)廣大農(nóng)村，甚至在東南亞各國(guó)也享有盛譽(yù)。民間主要用以治療糖尿病等多種疾病。現(xiàn)代研究表明，藤茶中主要含有黃酮類成分，以二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）含量最高，具有消炎抗菌、抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、保肝[4]、護(hù)胃[5]、降血糖[6]等作用。糖尿病以高血糖為主要特征，逐漸損傷血管和器官，最終出現(xiàn)威脅生命的并發(fā)癥。在這些并發(fā)癥的病理生理中，微小血管的改變起到十分重要的作用[7]。以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)DMY具有降血糖、抗氧化作用，但缺乏對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVECs）的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)HUVECs為基礎(chǔ)，通過(guò)觀察DMY對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的HUVECs損傷的作用，明確DMY對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，并初步探討其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和試劑：HUVECs由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。胎牛血清、PRMI1640培養(yǎng)液、0.25%胰酶-EDTA為Gibco公司產(chǎn)品，青/鏈霉素、活性氧（ROS）、細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）、細(xì)胞凋亡-Hoechst33258染色試劑盒購(gòu)于碧云天，MTT為sigma公司產(chǎn)品，DMY購(gòu)于成都曼思特公司，D-葡萄糖為biosharp公司產(chǎn)品，超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、微量丙二醛（MDA）測(cè)試盒購(gòu)于南京建成。

1.1.2 儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，多功能酶標(biāo)儀，細(xì)胞工作超凈臺(tái)，低速離心機(jī)，倒置顯微鏡，流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株的培養(yǎng)：HUVECs復(fù)蘇后，用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度為95%培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，隔天傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于本次實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：用不同濃度DMY（5 μg·mL-1，20μ g·mL-1，80μ g·mL-1）預(yù)處理保護(hù)HUVECs 12 h，分別為DMY低、中、高劑量組，再用0.5 mmol·L-1

H2O2

[8]干預(yù)12 h后進(jìn)行相應(yīng)的處理。1.2.3Hoechst33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化：按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.4 取上清液檢測(cè)SOD、MDA：按說(shuō)明書操作，分別于多功能酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為550 nm、532 nm處，測(cè)各管SOD、MDA吸光度。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化情況：分別按試劑盒說(shuō)明書處理后，避光保存，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理因素對(duì)HUVECs活力的影響與正常組相比，每組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中DMY濃度與HUVECs細(xì)胞活性呈負(fù)相關(guān)，以5μ g· mL-1保護(hù)作用最明顯。DMY 80μg·mL-1時(shí)細(xì)胞活力反低于H2O2組，可能與細(xì)胞不能耐受高濃度的DMY及高濃度存在細(xì)胞毒性有關(guān)。見表1。

表1 不同處理因素對(duì)HUVECs活力的影響（n=15，±s）

表1 不同處理因素對(duì)HUVECs活力的影響（n=15，±s）

與正常組比：aP＜0.05

組別細(xì)胞存活率正常組0.491±0 H2O2組0.491±0.021aDM Y低劑量組0.839±0.053aDM Y中劑量組0.552±0.071aDM Y高劑量組0.237±0.032a

2.2 Hoechst33258進(jìn)行細(xì)胞核染色正常HUVECs核呈彌散均勻低強(qiáng)度藍(lán)色熒光，胞核較大，形態(tài)規(guī)則，呈圓形或者橢圓形狀。H2O2組細(xì)胞核呈集中高強(qiáng)度藍(lán)色熒光，偶有些顏色發(fā)白，胞核較小，形態(tài)不規(guī)則，呈固縮致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。DMY（低、中、高劑量）組細(xì)胞核熒光強(qiáng)度隨濃度增加而增加，胞核由低強(qiáng)度逐漸趨于高強(qiáng)度熒光，形狀由規(guī)則圓形或者橢圓形逐漸呈不規(guī)則固縮致密濃染化，細(xì)胞數(shù)逐漸減少，見圖1。以上表明，DMY對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷起保護(hù)作用，且呈劑量負(fù)相關(guān)性，其最佳藥物濃度為5μ g·mL-1。

2.3 DMY組能顯著增加上清液SOD活性，降低MDA含量與正常組相比，H2O2誘導(dǎo)HUVECs出現(xiàn)SOD活性下降，MDA含量升高，引起氧化損傷。DMY增強(qiáng)清除自由基的能力，減少過(guò)氧化作用的發(fā)生，增強(qiáng)抗氧化能力，從而起保護(hù)細(xì)胞的作用，以5μg·mL-1DMY低劑量組尤為明顯。見表2。

圖1 不同濃度DMY對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞核形態(tài)學(xué)比較（×400）

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+濃度與正常組相比，H2O2引起HUVECs出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+積累，兩者呈正相關(guān)性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。DMY為強(qiáng)抗氧劑，DCFH-DA探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS反應(yīng)較為敏感，故DMY（低、中、高劑量）組ROS量與DMY濃度呈正相關(guān)，DMY（低、中、高劑量）組ROS量反低于正常組。與正常組相比，DMY（中、高劑量）組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但ROS水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故DMY（中、高劑量）組與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傊珼MY低劑量組，能顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平和Ca2+濃度，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），故DMY低劑量組對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞起最佳保護(hù)作用。見表3。

表2 DMY對(duì)細(xì)胞上清液SOD活性和MDA含量的影響（n=15，

表3 DMY對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca+濃度的影響（n=15，±s）

表3 DMY對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca+濃度的影響（n=15，±s）

與正常組比：aP＜0.05，bP＜0.05

組別 ROS Ca2+正常組158.667±26.502 1 075±103.407bH2O2組510.333±81.347a2 536.333±59.197bDM Y低劑量組 62.333±3.512a1 289±73.695bDM Y中劑量組 82±8.1851 540.333±133.155bDM Y高劑量組113.667±10.693 1 923±45.967b

3 討論

目前全球糖尿病患病率呈明顯上升趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到2030年將達(dá)5.52億。此外，在全球范圍內(nèi)有糖尿病前兆、糖耐量受損、胰島β細(xì)胞功能失調(diào)人群，到2030年將達(dá)3.98億。目前認(rèn)為糖尿病及其并發(fā)癥潛在的發(fā)生機(jī)制主要為氧化應(yīng)激，內(nèi)皮功能紊亂而引發(fā)糖尿病誘導(dǎo)血管性的疾病。研究表明內(nèi)皮功能紊亂往往先于糖尿病臨床癥狀出現(xiàn)[9-10]。糖尿病對(duì)微小血管的損傷導(dǎo)致血管硬化損傷是不可逆的。因此，通過(guò)早期診斷和優(yōu)化血糖控制以預(yù)防微小血管的損傷，減少并發(fā)癥[11]有著非常重要的作用。

SOD是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化物酶，在人體內(nèi)將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化成H2O2，從而減少超氧陰離子與一氧化氮反應(yīng)生成有活性的過(guò)氧硝酸鹽的可能性[12]，可間接反映細(xì)胞內(nèi)的抗氧化水平的情況。MDA是細(xì)胞內(nèi)自由基作用于多不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)后的產(chǎn)物，可間接反映脂質(zhì)過(guò)氧化水平的情況[13]。由于SOD和MDA都是氧化損傷在不同層次上的反應(yīng)，他們之間的表現(xiàn)有一致性。

ROS在糖尿病的發(fā)病和血管功能障礙的發(fā)展中扮演重要的角色。在糖尿病并發(fā)癥的靶細(xì)胞里發(fā)現(xiàn)線粒體ROS生成增加[14]。而細(xì)胞內(nèi)的Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，鈣穩(wěn)態(tài)是細(xì)胞正常存在的基礎(chǔ)。本研究使用H2O2模擬糖尿病內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，H2O2具有強(qiáng)氧化性，低濃度可導(dǎo)致正常細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，高濃度則出現(xiàn)壞死。H2O2引起細(xì)胞損傷的關(guān)鍵在于通過(guò)Ca2+作為第二信號(hào)，引發(fā)一系列細(xì)胞程序化死亡的信號(hào)傳導(dǎo)。ROS對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+有一定的調(diào)控作用。當(dāng)Ca2+濃度升高超過(guò)正常細(xì)胞內(nèi)Ca2+的閾值，Ca2+濃度升高可促進(jìn)胞內(nèi)ROS堆積，反之亦然，兩者在細(xì)胞凋亡中起重要作用。

氧化應(yīng)激的預(yù)防機(jī)制，有助于減少ROS的代謝產(chǎn)物及其衍生物的形成，包括SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）和過(guò)氧化氫酶（CAT）等。這些抗氧化酶水平影響各種組織氧化應(yīng)激的敏感性和糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。糖尿病的發(fā)生會(huì)增加脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的敏感性，這是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的形成的重要原因。DMY是一種具有抗氧化、抗感染等功效的黃酮類化合物。目前鮮有有關(guān)從細(xì)胞學(xué)角度出發(fā)探討DMY對(duì)糖尿病的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究DMY對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVECs的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制，證實(shí)DMY能增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)SOD活性，降低MDA含量，通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS、Ca2+從而對(duì)HUVECs起保護(hù)作用，以低濃度5μ g·mL-1DMY時(shí)效果最佳。關(guān)于其最佳保護(hù)藥物濃度，筆者認(rèn)為濃度越高，超過(guò)細(xì)胞本身負(fù)荷的能力，反造成細(xì)胞代謝的負(fù)擔(dān)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。不同于DMY對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，出現(xiàn)劑量依賴性，濃度越高，抗腫瘤越強(qiáng)[15]。

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（本文編輯：吳健敏）

Effect of dihydromyricetin against H2O2induced injury in human umbilical vein endothelial cell

LIU Yunxiao, PAN Xiaoqiong, HU Zhen.Department of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To investigate the effects of pretreatment with DMY on H2O2induced damage in human umbilical vein endothelial cell (HUVECs) and to explore the related mechanism.Methods:Groups were set as below: normal control group, H2O2group, groups for low, medium and high dosage of dihydromyricetin (DMY) respectively.Different concentrations of DMY (5 μg·mL-1, 20 μg·mL-1, 80 μg·mL-1) precultured HUVECs for 12 hours,then 0.5 mmol·L-1H2O2was used to invervene for 12 hours, using MTT to detect cell viability, Hoechst33258 for apoptotic nuclear staining, the supernatant was taken to determine SOD activity and MDA content. Flow cytometry was used to determine intracellular reactive oxygen species (ROS) and calcium levels.Results:DMY could significantly protect H2O2(0.5 mmol·L-1) after H2O2-induced injury in HUVECs (P<0.05). We found SOD activity in the supernatant of increased while MDA content and intracellular ROS expression including calcium concentration all decreased of which results became obvious when in 5 μg·mL-1solution of DMY. Conclusion: DMY can reduce intracellular ROS expression through intracellular Ca2+pathway, DMY concentration of 5 μg·mL-1has the most obvious effect.

dihydromyricetin; endothelial cell; SOD; MDA; ROS; intracellular Ca2+

R285.5

A

1000-2138（2014）04-0264-04

2013-10-10

溫州市扶工扶農(nóng)活動(dòng)和面向欠發(fā)達(dá)地區(qū)科研項(xiàng)目（2012-19）。

劉云霄（1988-），女，浙江瑞安人，碩士生。

胡臻，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：hz998@gmail. com。