陳淵，王偉，涂明，吳哲褒，鄭偉明

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 溫州 325015）

siRNA靶向沉默成纖維細(xì)胞激活蛋白α對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖的影響

陳淵，王偉，涂明，吳哲褒，鄭偉明

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 溫州 325015）

目的：探討小分子干擾RNA（siRNA）靶向沉默成纖維細(xì)胞激活蛋白α（FAP-α）表達(dá)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87增殖的影響。方法：實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（Blank組）、陰性對(duì)照組（NC組）和siRNA組，通過脂質(zhì)體將siRNA轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87，使用Western blot法檢測(cè)FAP-α基因的蛋白水平，同時(shí)檢測(cè)NC組和siRNA組Bcl-2、caspase-3的表達(dá)變化，使用Real-time PCR法檢測(cè)FAP-α和增殖核抗原（PCNA）的mRNA水平，CCK-8法評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染后NC組和siRNA組細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果：①轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA組細(xì)胞FAP-αmRNA、蛋白的表達(dá)明顯低于NC組和Blank組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），siRNA組較NC組caspase-3蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），siRNA組較NC組PCNA mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。②轉(zhuǎn)染后48、72和96 h siRNA組U87細(xì)胞吸光度值低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：應(yīng)用siRNA沉默F(xiàn)AP-α基因的表達(dá)，可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；小分子干擾RNA；成纖維細(xì)胞激活蛋白α；細(xì)胞增殖

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，其生長(zhǎng)快，生存率極低，目前的治療方法難以取得滿意的療效[1-2]。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞激活蛋白α（fibroblast activation protein alpha，F(xiàn)AP-α）選擇性表達(dá)于90%以上惡性上皮性腫瘤，在腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[3]。目前關(guān)于FAP-α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中研究較少，特別是膠質(zhì)瘤，關(guān)于其在膠質(zhì)瘤中的作用尚未有明確的結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)擬通過脂質(zhì)體將小分子干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87，靶向沉默F(xiàn)AP-α的表達(dá)，來(lái)探討其對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87由吳哲褒教授饋贈(zèng)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；SYBR Green Real time PCR Master Mix-Plus購(gòu)自TOYOBO公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自DOJINDO公司；FAP-α抗體購(gòu)自Abgent公司；caspase-3、Bcl-2購(gòu)自CST公司；GAPDH、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔Ig-G（H+L）購(gòu)自Bioworld公司；siRNA序列為：5’-GGUGGAUUCUUUGUUUCAATT-3’，5’-UUGAAACAAAGAA UCCACCTT-3’；陰性對(duì)照非特異性RNA序列為：5’-UU CUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，5’-ACGUGACACGUUCGGAG AATT-3’，均由上海吉瑪公司合成；相應(yīng)PCR引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 基因的引物序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：U87細(xì)胞用含有10%血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。將U87細(xì)胞分為3組，分別為空白對(duì)照組（Blank組）、陰性對(duì)照組（NC組）和siRNA組。接種于培養(yǎng)板，待生長(zhǎng)融合至70%～80%時(shí)用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體步驟按說明書操作。

1.2.2 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后48 h各組細(xì)胞分別用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行Real-time PCR。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min，一個(gè)循環(huán)；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)模板均生物學(xué)重復(fù)3次，目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt表示，其中ΔΔCt=［Ct目的基因（待測(cè)樣品）-Ct內(nèi)參照（待測(cè)樣品）］-［Ct目的基因（校正樣品）-Ct內(nèi)參照（校正樣品）］。

1.2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)：各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后分別提取總蛋白，BCA法蛋白測(cè)定。SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛奶室溫封閉2 h后，加入相應(yīng)一抗，抗體稀釋度為GAPDH（1:5 000）、FAP-α（1:1 000）、Bcl-2（1:1 000）、caspase-3（1:1 000），4 ℃孵育過夜，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。用Gel-Pro軟件分析，以同一樣品中目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白的相對(duì)定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以合適的密度接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分為2組：NC組和siRNA組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)置5個(gè)調(diào)零孔，轉(zhuǎn)染后時(shí)間設(shè)置為0 h，分別在24、48、72和96 h采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。定量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞FAP-αmRNA和蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)染Blank組、NC組和siRNA組FAP-αmRNA表達(dá)分別為：1.01±0.17、0.87±0.17、和0.14 ±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），轉(zhuǎn)染siRNA組FAP-αmRNA表達(dá)水平明顯低于NC組和Blank組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。轉(zhuǎn)染Blank組、NC組和siRNA組FAP-α蛋白表達(dá)分別為：0.74±0.01、0.73±0.04、和0.21± 0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），轉(zhuǎn)染siRNA組FAP-α蛋白表達(dá)水平明顯低于NC組和Blank組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果與Real-time PCR一致，見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞FAP-α蛋白和mRNA表達(dá)變化

2.2 轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞增殖的變化與NC組比較，轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h siRNA組吸光度值（OD450值）降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染后24 h二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞增殖的變化

2.3 轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞Bcl-2、caspase-3和PCNA的表達(dá)Western blot法檢測(cè)Bcl-2、caspase-3蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：siRNA組較NC組caspase-3蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。Real-time PCR檢測(cè)PCNA的表達(dá)結(jié)果顯示：siRNA組較NC組PCNA mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.01），見圖3。

3 討論

FAP-α是一種具有761個(gè)氨基酸的I I型穿膜糖蛋白[4]，基因定位于染色體2q23[5]，與多種疾病有關(guān)，包括創(chuàng)口愈合、慢性炎癥和腫瘤等。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，F(xiàn)AP-α的高表達(dá)與腫瘤的高危轉(zhuǎn)移、低存活率、復(fù)發(fā)和極差預(yù)后密切相關(guān)[6-8]，但具體的機(jī)制仍不明確。Huang等[9]用建立了表達(dá)FAP-α的小鼠乳腺腫瘤移植模型,發(fā)現(xiàn)該模型腫瘤生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于對(duì)照組，提示FAP-α具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用。溫秋婷等[10]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FAP能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。同樣的，朱琳等[11]研究發(fā)現(xiàn)FAP在體外可促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移和小管形成，提示其在腫瘤血管生成起到一定的作用。

圖3 轉(zhuǎn)染后Bcl-2、caspase-3蛋白和PCNA mRNA表達(dá)情況

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的腫瘤，治療手段有限，預(yù)后極差?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)FAP-α在正常腦組織中低表達(dá)或不表達(dá)，在星形細(xì)胞癌中，F(xiàn)AP-α的表達(dá)是與WHO分級(jí)相關(guān)的[12]，病理級(jí)別越高，F(xiàn)AP-α表達(dá)越強(qiáng)并與膠質(zhì)瘤的侵襲性有關(guān)[13]。目前關(guān)于FAP-α與神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖的研究報(bào)道尚少。本實(shí)驗(yàn)研究沉默F(xiàn)AP-α的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87增殖的影響，我們用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA，沉默F(xiàn)AP-α的表達(dá)，運(yùn)用Real-time PCR和Western Blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后靶基因的表達(dá)變化，證實(shí)與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組FAP-α基因的mRNA和蛋白水平均有明顯的下降。

研究發(fā)現(xiàn)，PCNA與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)[14]，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[15]。我們通過Real-time PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后siRNA組較NC組PCNA表達(dá)明顯下降，隨著靶基因的表達(dá)下調(diào)而下降。提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力的下降。同樣的，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力均分別低于相應(yīng)對(duì)照組，并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而差距變大。由此說明有效的沉默F(xiàn)AP-α的表達(dá)，可以促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)增殖能力下降，并增加和促進(jìn)其凋亡。

凋亡是細(xì)胞程序性自殺的過程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡能抑制細(xì)胞增殖，是目前抗腫瘤的一種潛在的方法[16]。Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的原癌基因，可以穩(wěn)定線粒體電位，抑制CytC釋放來(lái)抑制凋亡的線粒體依賴途徑，其異常的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系[17]。caspase-3是目前發(fā)現(xiàn)的caspase成員中引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性激酶，也是細(xì)胞凋亡的主要參與成分。caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)在凋亡通路中處于重要地位，尤其caspase-3是其中的中心環(huán)節(jié)[18]。本研究中細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后發(fā)現(xiàn)，下調(diào)FAP-α的表達(dá)可以顯著抑制Bcl-2蛋白水平并上調(diào)caspase-3表達(dá)，說明下調(diào)FAP-α的表達(dá)能誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡。綜上所述，通過本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)FAP-α的表達(dá)下調(diào)能夠使膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力下降，促進(jìn)凋亡發(fā)生。因此FAP-α有可能成為臨床治療膠質(zhì)瘤的靶點(diǎn)。但本研究?jī)H以神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87為研究對(duì)象，探討下調(diào)表達(dá)FAP-α對(duì)U87細(xì)胞的影響，關(guān)于在其他膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的情況，以及在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展和診療中的作用機(jī)制研究仍不清楚，還需進(jìn)一步的研究。

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（本文編輯：吳健敏）

Effect of siRNA on proliferation of glioma cell line U87 by targeting fibroblast activation protein alpha

CHEN Yuan, WANG Wei, TU Ming, WU Zhebao, ZHENG Weiming.Department of Neurosurgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To explore the effect of small interfering RNA (siRNA) -mediated fibroblast activation protein alpha knock-down on proliferation of glioma cell line U87.Methods:The experiment is divided into Blank, NC and siRNA. Negative control or siRNA were transfected into U87cells by Lipofectamine 2000. After transfection, protein level of target gene FAP-α, Bcl-2 and caspase-3 were detected by Western blot, mRNA level of PCNA and FAP-αwere detected by Real-time PCR. The proliferation ability of NC group and siRNA group of cells were analyzed by CCK8 assay.Results:①Forty-eighth after transfection, mRNA and protein expressions of FAP-α in siRNA group were remarkably reduced as compared with those in NC and Blank group (P<0.05); Compared with NC group, the expression of caspase-3 was higher (P<0.05), while that of Bcl-2 was lower (P<0.01). The expression of PCNA mRNA was lower than NC group (P<0.01). ②The OD450 value of siRNA group was significantly lower than that in the NC group 24, 48, 72 and 96 h after transfection (P<0.05). Conclusion: siRNA-mediated fibroblast activation protein alpha knock-down can inhibit the proliferation of U87 glioma cells and promote apoptosis of glioma cells.

glioma; small interfering RNA; fibroblast activation protein alpha; cell proliferation function

R739.41

A

1000-2138（2014）04-0241-04

2013-10-28

浙江省外科學(xué)重中之重學(xué)科開放基金資助項(xiàng)目（kfjj2011006）。

陳淵（1988-），男，浙江臺(tái)州人，碩士生。

鄭偉明，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：zhwm61@ 126.com。