張悅，陳文銘，謝遲遲，謝雙雙，孫君慧，徐芝慧，劉軍，周穎

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)研究中心，廣西 南寧 530021；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325015；3. 澳大利亞莫納什大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究所，克萊頓 3800）

豚鼠卵巢組織片和分離的竇前卵泡玻璃化冷凍效果比較

張悅1，陳文銘2，謝遲遲2，謝雙雙2，孫君慧2，徐芝慧2，劉軍3，周穎2

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)研究中心，廣西 南寧 530021；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325015；3. 澳大利亞莫納什大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究所，克萊頓 3800）

目的：比較分析不同玻璃化冷凍配方對(duì)豚鼠卵巢組織片和單個(gè)竇前卵泡形態(tài)、存活率及體外發(fā)育能力的影響。方法：取5周齡雌性豚鼠卵巢，實(shí)驗(yàn)分新鮮對(duì)照組、組織片A液毒性組、組織片B液毒性組、卵泡A液毒性組和卵泡B液毒性組，及相應(yīng)的凍融組，即組織片A液凍融組、組織片B液凍融組、卵泡A液凍融組、卵泡B液凍融組，共9組行毒性試驗(yàn)和冷凍保存。各組卵巢組織片行HE染色形態(tài)學(xué)觀察，分離竇前卵泡經(jīng)錐蟲(chóng)藍(lán)染色活力測(cè)試并行體外培養(yǎng)。結(jié)果：A液凍融組和B液凍融組豚鼠卵巢組織片HE染色光鏡觀察可見(jiàn)大部分卵泡形態(tài)正常，A液組和B液組異常竇前卵泡數(shù)與新鮮對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在分離的竇前卵泡錐蟲(chóng)藍(lán)染色活力測(cè)試中，凍融卵巢組織片A 組的卵泡復(fù)蘇率（為66.1%）顯著低于（P＜0.05）凍融卵泡B液組（為78.5%）和新鮮對(duì)照組（為87.5%）；其余組別之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外培養(yǎng)卵泡發(fā)育情況組織片冷凍組比卵泡冷凍組差，以A液組尤甚，第6天存活卵泡數(shù)目不足（為20.0%），與新鮮對(duì)照組（為60.0%）及卵泡B液凍融組（為50.0%）相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：玻璃化冷凍法能較好地冷凍保存豚鼠卵巢組織片和分離的竇前卵泡，而單個(gè)豚鼠竇前卵泡玻璃化冷凍優(yōu)于卵巢組織片的玻璃化冷凍；B液較A液更適合豚鼠卵巢卵泡的玻璃化冷凍保存。竇前卵泡的體外培養(yǎng)證明玻璃化冷凍復(fù)蘇卵泡具有一定的繼續(xù)發(fā)育能力。

玻璃化；冷凍保護(hù)劑；豚鼠；竇前卵泡

隨著人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)冷凍保存卵巢組織或卵泡經(jīng)體外培養(yǎng)及體外成熟技術(shù)獲得大量成熟并具有受精能力的卵母細(xì)胞已成為可能。這可以幫助因疾病必須切除卵巢，或必須行放、化療可能損傷卵巢功能[1]的女性患者保存生育能力[2-3]。竇前卵泡是潛在的獲得卵母細(xì)胞的巨大的來(lái)源，而豚鼠竇前卵泡的發(fā)育與人相似[4]。且豚鼠體積小，繁殖快，可大量獲取實(shí)驗(yàn)所需材料。因此研究豚鼠竇前卵泡的冷凍保護(hù)將對(duì)保存女性生殖能力及瀕危物種有巨大的意義。本研究比較分析豚鼠卵巢組織片和分離的竇前卵泡玻璃化冷凍效果，為篩選更為適合豚鼠卵泡冷凍保存的玻璃化方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑L-15（Sigma，L4386），胎牛血清（FBS，Sigma，ZLI-9039），I型膠原酶（Sigma，C0130），DNA酶I（Sigma，DN-25），α-MEM（Gibco，12571），二甲基亞砜（DMSO，Sigma，D-2650），乙二醇（EG，Sigma，E-9129），蔗糖（Sigma，S1888），F(xiàn)icoll-70（Sigma，06841），重組人FSH（r-hFSH，Merck Serono），錐蟲(chóng)藍(lán)（Sigma，T8154）。

A液組的平衡液（ES液）為7.5% DMSO+7.5% EG +L-15，冷凍液（VS液）成分為15% DMSO+15% EG +L-15；B液組中ES液為10% EG+4.5% Ficoll-70+ 0.075 mol/L蔗糖，VS1液為20% EG+9.0% Ficoll-70+0.15 mol/L蔗糖，VS2液為40% EG+18% Ficoll-70+0.3 mol/L蔗糖，A、B兩液組的解凍液均為含1 mol/L、0.5 mol/L及0.25 mol/L蔗糖的L-15。

卵泡酶解液組成為2.5 mg/mL I型膠原酶+100 μg/mL DNA酶I+PBS。

1.2 卵巢的獲取和處理5周大150 g雌性豚鼠30只，購(gòu)自上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。頸椎脫臼處死豚鼠，使用無(wú)菌取材器械剖腹取出卵巢，放入預(yù)冷的取材液中，30 min內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。 在凈化工作臺(tái)中，將卵巢移入盛有取材液（L-15+10% FBS）的培養(yǎng)皿（Falcon，353037）中，置于體視顯微鏡下，用顯微器械剔除血管及卵巢周?chē)Y(jié)締組織。

1.2.1 卵巢組織片：實(shí)驗(yàn)分新鮮對(duì)照組、組織片A液毒性組、組織片B液毒性組、組織片A液凍融組、組織片B液凍融組。毒性試驗(yàn)為毒性組與冷凍組在相同條件下平衡于冷凍液和解凍液中，但不經(jīng)歷冷凍與解凍過(guò)程。每組隨機(jī)挑取半片卵巢放入甲醛固定，其余備用。

1.2.2 分離竇前卵泡：分新鮮對(duì)照組、卵泡A液毒性組和卵泡B液毒性組、卵泡A液凍融組、卵泡B液凍融組。將卵巢片轉(zhuǎn)入含1 mL酶解液的培養(yǎng)皿（Falcon，353037）中，置于38.5 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育30 min后，加入等體積胎牛血清終止酶解。細(xì)胞懸液50 g離心5 min，吸取上清液丟棄，加等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。挑取基膜完整的竇前卵泡（顆粒細(xì)胞2～5層）移入預(yù)先平衡的培養(yǎng)皿（Falcon，353002）覆蓋有礦物油（Sigma，33076）的30 μL基礎(chǔ)液微滴中存放于38.5 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.3 冷凍與解凍及毒性試驗(yàn)

1.3.1 分離竇前卵泡玻璃化冷凍與解融及毒性試驗(yàn)：選取每半卵巢用消毒刀片切成4～6塊大小相近的組織片，酶解加機(jī)械法分離獲得的竇前卵泡分5組，標(biāo)記為卵泡A液凍融組與卵泡B液凍融組、卵泡A液毒性組、卵泡B液毒性組及新鮮卵泡對(duì)照組。卵泡A液凍融組：將卵泡用巴氏吸管吸取移至ES液滴中停留10 min，然后分別移至VS液滴停留3 min。再將竇前卵泡置于載桿親水端，立即投入液氮，最后移入液氮灌保存。卵泡B液凍融組：竇前卵泡移至ES冷凍液滴停留7 min。再分別過(guò)VS1、VS2冷凍液滴停留2 min、1 min。移至載桿，投入液氮做好標(biāo)記。液氮儲(chǔ)存至少1周后進(jìn)行解凍,卵泡解凍：將載桿從液氮中取出，載有卵泡的一端迅速浸入解凍液中，分別經(jīng)過(guò)1 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L蔗糖L-15溶液，每次5 min。卵泡毒性試驗(yàn)A液、B液組不進(jìn)行液氮冷凍，僅經(jīng)過(guò)相應(yīng)冷凍液和解凍液浸泡過(guò)程。各組卵泡均移入預(yù)先平衡的培養(yǎng)皿（Falcon，353002）覆蓋有礦物油（Sigma，33076）的30 μL基礎(chǔ)液微滴中存放于38.5 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.3.2 卵巢組織片玻璃化冷凍與解融及毒性試驗(yàn)：將卵巢用無(wú)菌鑷子夾到清潔消毒過(guò)的紗布上，用消毒刀片切成4～6塊大小相近的組織片。隨機(jī)平均分配所有組織片為5組，分別標(biāo)記為組織片A液凍融組、組織片B液凍融組及組織片A液毒性組、組織片B液毒性組和新鮮組織片對(duì)照組。組織片A液凍融組：室溫下將組織塊移入平衡液ES中停留10 min，然后移入VS冷凍液中3 min，之后取出卵巢組織片置于紗布上吸去表面冷凍液，放入1.8 mL冷凍管（預(yù)先做好標(biāo)記）中，4～6片/管，澆上液氮，立即投入液氮進(jìn)行冷凍保存。組織片冷凍B液組：室溫下將卵巢組織片移入ES液中停留7 min 隨后移入VS1液、VS2液中逗留2 min、1 min，余操作步驟A組。液氮儲(chǔ)存至少1周后解凍。從液氮罐中取出冷凍管，先于室溫下放置1 min，再放至37 ℃水浴中輕輕搖晃至液氮出現(xiàn)部分溶化，用無(wú)菌鑷子取出組織片分別經(jīng)過(guò)1 mol/L、0.5 mol/L及0.25 mol/L蔗糖L-15溶液，每次5 min。組織片毒性A、B組不進(jìn)行液氮冷凍，僅經(jīng)過(guò)相應(yīng)冷凍液和解凍液浸泡過(guò)程。將各組組織片取2～3小塊放入甲醛中固定，其余移至加有1 mL酶解液的3037培養(yǎng)皿中分離竇前卵泡，將卵泡移入預(yù)先平衡的培養(yǎng)皿（Falcon，353002）覆蓋有礦物油的30μ L基礎(chǔ)液微滴中，存放于38.5 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱。

1.4 錐蟲(chóng)藍(lán)卵泡活力測(cè)試由5 μL 4%錐蟲(chóng)藍(lán)溶液+100 μL L-15液組成染液，用移液器在培養(yǎng)皿（Falcon，353002）上制成15～18個(gè)200μL錐蟲(chóng)藍(lán)微滴，上面覆蓋組織培養(yǎng)油。將各組基膜完整的竇前卵泡移入200μ L染液中室溫下染色15 min后轉(zhuǎn)移入事先制成的20μ L染液觀察滴中，每個(gè)觀察滴含5個(gè)竇前卵泡。400倍顯微鏡下（德國(guó)蔡司，Axio106）觀察卵泡著色情況。20 min內(nèi)由兩人分別鏡檢評(píng)估，死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞未染色（見(jiàn)圖1）。卵泡活力分級(jí)按照J(rèn)ewgenow等[5]所采用的標(biāo)準(zhǔn)：I級(jí)0～3個(gè)（＜10%）顆粒細(xì)胞著色，并且卵細(xì)胞不明顯著色；I I級(jí)4～15個(gè)（10%～50%）顆粒細(xì)胞著色，卵細(xì)胞不明顯著色；I I I級(jí)0～3個(gè)（＜10%）顆粒細(xì)胞著色，卵細(xì)胞明顯著色；IV級(jí)4～15個(gè)（10%～50%）顆粒細(xì)胞著色，卵細(xì)胞明顯著色；V級(jí)＞50%顆粒細(xì)胞著色。結(jié)果判定：I級(jí)和I I級(jí)為活的卵細(xì)胞，I級(jí)和I I I級(jí)為活的顆粒細(xì)胞。錐蟲(chóng)藍(lán)染色卵泡存活率及復(fù)蘇率計(jì)算公式：存活率=[活卵泡數(shù)/（死卵泡數(shù)+活卵泡數(shù)）]×100%；復(fù)蘇率=（冷凍復(fù)蘇后卵泡存活率/新鮮卵泡存活率）×100%。

圖1 顯微鏡下分離卵泡錐蟲(chóng)藍(lán)染色結(jié)果（×400）

1.5 竇前卵泡的體外培養(yǎng)選取各組中錐蟲(chóng)藍(lán)活力試驗(yàn)的I級(jí)和I I級(jí)卵泡進(jìn)行體外培養(yǎng)，將存活的竇前卵泡移入96孔培養(yǎng)板中，每孔含300μL培養(yǎng)液（1 mL ITS+10 unit r-hFSH 20 μL+5% FBS 5 mL+1 mL雙抗+94 mL α-MEM/100 mL），每孔移入1個(gè)卵泡。培養(yǎng)板置于38.5 ℃，100%濕度，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)6 d。加入卵泡日為培養(yǎng)第0天，分別于第2、第4、第6天，即隔日換一半培養(yǎng)液（150 μL）。每次換液后在倒置顯微鏡下觀察，判斷并記錄卵泡存活數(shù)、死亡卵泡數(shù)和異常卵泡數(shù)。竇前卵泡發(fā)育過(guò)程中的質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：健康的卵泡呈圓形或橢圓形，基底膜完整，部分可見(jiàn)圓而明亮的卵母細(xì)胞，顆粒細(xì)胞密而緊湊，無(wú)致密體，呈持續(xù)生長(zhǎng)判為存活正常卵泡。凡出現(xiàn)基膜出現(xiàn)缺口、立體結(jié)構(gòu)塌陷、卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常判為結(jié)構(gòu)異常卵泡。如果胞質(zhì)不勻色暗，呈現(xiàn)大量異常顆粒樣物質(zhì)或卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞降解、嚴(yán)重皺縮、生長(zhǎng)停滯視為死亡卵泡。

1.6 組織形態(tài)學(xué)檢查卵巢組織片新鮮對(duì)照組、玻璃化A液凍融組、玻璃化B液凍融組隨機(jī)挑取縱切的半片卵巢置于固定液（4%多聚甲醛）中固定24 h，脫水、石蠟包埋，4μ m厚連續(xù)切片60張，行蘇木精伊紅（HE）染色，每隔5張切片在高倍光鏡（× 400）下，選擇相對(duì)卵泡密度高的視野觀察玻片，并拍照片記錄。每個(gè)標(biāo)本共計(jì)數(shù)10個(gè)高倍光鏡視野，計(jì)數(shù)含卵細(xì)胞核的竇前卵泡總數(shù)及正常、異常卵泡數(shù)，卵泡分類(lèi)按照Sadeu等[4]分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS16.0軟件。用卡方檢驗(yàn)和單因素方差分析（one way ANOVA）比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵泡分離與錐蟲(chóng)藍(lán)染色活力測(cè)試毒性試驗(yàn)各組分離的卵泡大部分為存活卵泡，其中新鮮對(duì)照組分離的竇前卵泡存活率最高，組織片毒性組和卵泡毒性組比較新鮮對(duì)照組卵泡存活率稍低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表1）。

表1 毒性試驗(yàn)各組分離竇前卵泡數(shù)及錐蟲(chóng)藍(lán)活力測(cè)試結(jié)果

各凍融實(shí)驗(yàn)組分離的卵泡存活率低于新鮮對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表2）。而組織片凍融組中，A液組與B液組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在卵泡凍融組中，A液組與B液組差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但卵泡A、B凍融組卵泡復(fù)蘇率顯著高于組織片A、B凍融組卵泡復(fù)蘇率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)中形態(tài)記錄圖（×400）

表2 凍融實(shí)驗(yàn)各組分離竇前卵泡數(shù)及錐蟲(chóng)藍(lán)活力測(cè)試結(jié)果

2.2 竇前卵泡的體外培養(yǎng)如圖2所示，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組均出現(xiàn)部分卵泡逐漸失去立體結(jié)構(gòu)，卵泡塌陷，基膜破裂，卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞分離，卵母細(xì)胞逸出，甚至結(jié)構(gòu)解體死亡，正常卵泡存活數(shù)減少而異常卵泡數(shù)及死亡卵泡數(shù)逐漸增多。組織片A液、B液凍融組卵泡發(fā)育情況差，以A液凍融組尤甚，在第2天出現(xiàn)多數(shù)卵泡的卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞分離卵母細(xì)胞排出、變黑現(xiàn)象，而在第4天過(guò)半卵泡出現(xiàn)死亡，第6天時(shí)存活卵泡數(shù)目不足20.0%。卵泡冷凍組的卵泡培養(yǎng)情況好于組織片冷凍組，相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中卵泡B液凍融組第6天卵泡存活率達(dá)50.0%，與新鮮組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各毒性組之間卵泡培養(yǎng)情況相類(lèi)似，與新鮮對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)圖3-4）。

圖3 毒性組竇前卵泡體外培養(yǎng)第2天到第6天卵泡存活率比較

2.3 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察新鮮對(duì)照組、組織片A液凍融組和B液凍融組豚鼠卵巢組織切片HE染色均可見(jiàn)各級(jí)卵泡（見(jiàn)圖5），卵巢皮質(zhì)以竇前卵泡為主，大部分卵泡呈圓形或卵圓型，有完整的顆粒細(xì)胞層，色澤明亮，層次分明，顆粒細(xì)胞層周?chē)饣?；少量卵泡表現(xiàn)為基底膜模糊或破損，卵泡細(xì)胞松散或游離到卵泡外，卵母細(xì)胞逸出卵泡，變形或崩解。A液凍融組和B液凍融組都保存大部分卵泡存活，兩組之間的異常卵泡數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而與新鮮對(duì)照組比較，AB凍融組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

圖4 凍融組竇前卵泡體外培養(yǎng)第2天到第6天卵泡存活率比較

圖5 豚鼠卵巢片組織切片HE染色（×200）

表3 各組卵巢組織切片HE染色竇前卵泡形態(tài)及計(jì)數(shù)比較

卵巢皮質(zhì)的冷凍因其含有大量的原始卵泡，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，更能耐受冷凍損傷而存在優(yōu)勢(shì)，且不延誤腫瘤患者的最佳治療時(shí)機(jī)，是癌癥患者放化療前生育力保存的主要方法，適合于生育年齡及青春期前的高治愈率女性癌癥患者。與精子、胚胎等冷凍已存在較為標(biāo)準(zhǔn)和成熟的冷凍方案相比，多種細(xì)胞成分組成的卵巢組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因而冷凍更具有挑戰(zhàn)性。目前卵巢組織冷凍保存方法主要有程序化冷凍方法和玻璃化冷凍法。前者應(yīng)用低濃度冷凍保護(hù)劑在程序冷凍儀控制下緩慢降溫使得細(xì)胞內(nèi)水份與細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑充分交換滲透達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用，需要精密儀器的高昂費(fèi)用，耗時(shí)耗人力，難以在基層醫(yī)療單位推廣應(yīng)用。玻璃化冷凍方法中高濃度冷凍保護(hù)劑滲透入細(xì)胞內(nèi)以提高胞漿黏稠度，通過(guò)快速降溫使細(xì)胞形成玻璃化態(tài)，減少甚至避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成，減輕溶質(zhì)損傷，且無(wú)需精密儀器控制降溫，操作簡(jiǎn)便，容易推廣。傳統(tǒng)的玻璃化冷凍是采用麥管封閉式裝載卵巢組織，冷凍降溫速度達(dá)1 500 ℃/min。如何提高冷凍降溫速度是玻璃化技術(shù)的關(guān)鍵，因此人們通過(guò)改良方法如采用尼龍網(wǎng)、電鏡銅網(wǎng)、開(kāi)放拉細(xì)麥管（OPS）、cryoloop等開(kāi)放系統(tǒng)裝載卵巢組織，直接與液氮接觸來(lái)加快冷凍降溫速度達(dá)15 000 ℃/min，使組織細(xì)胞較好的形成“玻璃化”狀態(tài)，盡量減少冰晶的形成。但這種改良方法不一，冷凍保護(hù)劑也五花八門(mén)，至今沒(méi)有統(tǒng)一的冷凍保護(hù)劑和方法。玻璃化冷凍中采用的冷凍保護(hù)劑配方和降溫速率是關(guān)鍵問(wèn)題，在本實(shí)驗(yàn)中我們采用液氮直接覆蓋玻璃化冷凍法（direct cover vitrification，DCV）[6-7]和兩組玻璃化冷凍保護(hù)液，玻璃化冷凍A液（DMSO+EG）為常用冷凍保護(hù)劑配方，玻璃化冷凍B液（EG+Ficoll）[8]的實(shí)驗(yàn)研究較為少見(jiàn)，但都未見(jiàn)在豚鼠卵巢冷凍方面的應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)卵巢組織片固定切片HE染色結(jié)果顯示凍融卵巢皮質(zhì)以竇前卵泡為主，大部分竇前卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)正常完好保存，其中A液凍融組復(fù)蘇卵泡形態(tài)學(xué)結(jié)果與周新惠等[9]的大鼠卵巢組織使用相同濃度DMSO+EG進(jìn)行冷凍保護(hù)效果相似。而A液與B液對(duì)豚鼠卵巢組織片冷凍效果也無(wú)明顯差異，但A液凍融組與B液凍融組的異常卵泡率與新鮮對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明玻璃化冷凍過(guò)程對(duì)豚鼠卵巢卵泡的形態(tài)結(jié)構(gòu)造成一定的影響，導(dǎo)致異常卵泡數(shù)的增加，可能原因是高濃度冷凍保護(hù)劑對(duì)卵泡的毒性損傷，因此如何減少其對(duì)細(xì)胞的損害，應(yīng)該在不影響滲透效果的前提下，盡可能降低冷凍保護(hù)劑的濃度，縮短滲透時(shí)間，另一方面，很有可能是由于冷凍保護(hù)劑未能充分滲透入卵巢組織片因而對(duì)卵泡沒(méi)有起到較好的保護(hù)效果導(dǎo)致異常卵泡增多?？梢試L試通過(guò)增加組織片平衡時(shí)間實(shí)驗(yàn)來(lái)改善這一情況。因此如何尋找冷凍保護(hù)劑濃度與平衡時(shí)間的契合點(diǎn)是研究者努力的方向。

在卵泡錐蟲(chóng)藍(lán)染色活力檢測(cè)中，本研究的毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，實(shí)驗(yàn)各組與新鮮對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明玻璃化冷凍液的短時(shí)間滲透對(duì)卵泡的損害較輕微。而對(duì)于冷凍實(shí)驗(yàn)組而言，單個(gè)竇前卵泡凍融組對(duì)比組織片凍融組，其中卵泡B液凍融組卵泡存活率則明顯高于組織片A液凍融組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與報(bào)道[10]研究結(jié)果一致：同種冷凍保護(hù)液同樣浸液時(shí)間情況下，單個(gè)卵泡冷凍效果比卵巢組織片好，可能是由于卵巢組織體積相對(duì)大且致密，同樣時(shí)間的冷凍保護(hù)劑滲透不夠充分，而單個(gè)卵泡則能滲透充分，形成較好的脫水效果。

卵巢卵泡冷凍保存的目的是為了保持年輕女性癌癥患者的生育力，需要將凍融卵巢卵泡進(jìn)行體內(nèi)（移植）或體外培養(yǎng)，獲得有受精能力的卵母細(xì)胞，才有可能獲得妊娠，恢復(fù)生育功能。因此應(yīng)用竇前卵泡體外培養(yǎng)法來(lái)檢測(cè)其體外發(fā)育能力是衡量卵巢/卵泡冷凍保存效果的不可或缺的指標(biāo)之一[11]。本實(shí)驗(yàn)中豚鼠卵巢組織片凍融組的竇前卵泡培養(yǎng)效果不甚理想，而卵泡凍融組的竇前卵泡存活率也低于新鮮對(duì)照組，且培養(yǎng)僅6 d，絕大部分卵泡的立體結(jié)構(gòu)喪失，卵泡存活率不超過(guò)50%。可能是培養(yǎng)條件的不適宜不同物種之間的差異或者培養(yǎng)方法（普通培養(yǎng)方法）的局限性等，其他學(xué)者也都有類(lèi)似報(bào)道，凍融卵泡經(jīng)培養(yǎng)后發(fā)育遲緩，存活率明顯下降[12-13]。如何在體外培養(yǎng)過(guò)程中維持卵泡立體結(jié)構(gòu)的完整性是研究者所面臨的難題。有研究[14]發(fā)現(xiàn)竇前卵泡在體外培養(yǎng)期間顆粒細(xì)胞有逐漸與卵母細(xì)胞分離的趨勢(shì)，導(dǎo)致卵泡結(jié)構(gòu)崩解，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。多年來(lái)學(xué)者們運(yùn)用了卵泡二維、三維培養(yǎng)法等試圖維持顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)完整性，取得一定的成功。這方面仍然值得我們進(jìn)一步的研究，以找尋最優(yōu)冷凍保存及培養(yǎng)方法，為現(xiàn)代女性生殖能力保存及物種保護(hù)方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，玻璃化冷凍液毒性試驗(yàn)對(duì)卵泡并未造成明顯的損害；而凍融過(guò)程導(dǎo)致豚鼠卵巢存活卵泡數(shù)量有所下降，可見(jiàn)凍融過(guò)程是造成豚鼠卵巢卵泡損害的主要原因。玻璃化冷凍法能較好地冷凍保存豚鼠卵巢組織片和分離的竇前卵泡，而單個(gè)豚鼠竇前卵泡玻璃化冷凍效果優(yōu)于卵巢組織片的玻璃化冷凍；B液較A液更適合豚鼠卵巢卵泡的玻璃化冷凍保存。竇前卵泡的體外培養(yǎng)證明玻璃化冷凍復(fù)蘇卵泡具有一定的繼續(xù)發(fā)育能力。

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（本文編輯：吳健敏）

Comparative study between guinea pig ovarian fragments and isolated preantral follicles cryopreservation with vitrification

ZHANG Yue1, CHEN Wenming2, XIE Chichi2, XIE Shuangshuang2, SUN Junhui2, XU Zhihui2, LIU Jun3, ZHOU Ying2.1.The Reproductive Medicine Centre, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning, 530021; 2.Centre for Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 3.Monash Institute of Medical Research, Monash University, Clayton, 3800

Objective:To compare the follicle morphology, survival rate and in vitro growth potential of guinea pig ovarian fragments and isolated preantral follicles after vitrification.Methods:Five- weeks aged female guinea pigs were used. Two vitrification solutions (solution A and B) were applied to vitrify guinea pig ovarian fragments and isolated preantral follicles. The toxicity and cryopreservation efficiency of the two solutions were tested on both fragments and isolated preantral follicles. The ovaries were observed using hematoxylin and eosin staining; the viability of the follicles was evaluated by trypan blue. The isolated preantral follicle was cultured in vitro to evaluated the follicle development potential.Results:Based on morphological analyze, the majority follicles were normal in fragments cryopreservation, but the abnormal follicle were higher than fresh group, P<0.05. The recover rates of follicle after being thawed using trypan blue were 66.1% in solution A fragment vitrification group, significantly lower than that in solution B follicle vitrification group (78.5%) and fresh group (87.5%), P<0.05. No significance was found among other groups. During in vitro culture, the vitrifiedfragments showed poorer develop potential than follicle vitrification groups, typically solution A fragment group, and the follicle survival rate by day 6 was lower than (20.0%), significantly lower than fresh group (60.0%) and solution B follicle vitrification group (50.0%), P<0.05. Conclusion: The results show that the vitrification can preserve guinea pig ovarian fragments and isolated preantral follicles, the latter one achieved better results. Solution B was more efficient in preserving guinea pig follicles. The follicles show growth potential during in vitro culture after being thawed.

vitrification; cryoprotectant; guinea pig; preantral follicles

R318.52

A

1000-2138（2014）04-0252-06

2013-11-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30370749）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY13C120002）；浙江省科技廳科研基金資助項(xiàng)目（2003C33001）；溫州市科技局對(duì)外合作項(xiàng)目（H20080061）。

張悅（1988-），女，浙江東陽(yáng)人，碩士生。

周穎，教授，Email：zy-yin@163.com。