張 虹 汪 洋 袁紅梅 尤鳳麗 黃永紅

大慶師范學(xué)院

石油脫硫菌的篩選與培養(yǎng)基優(yōu)化*

張 虹 汪 洋 袁紅梅 尤鳳麗 黃永紅

大慶師范學(xué)院

生物脫硫（BDS）技術(shù)具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、設(shè)備投資和操作費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)燃料油深度脫硫最有效的技術(shù)之一。實(shí)驗(yàn)分離得到6株可降解DBT的脫硫菌，經(jīng)比較確定了B5為高效脫硫菌株，需進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定。對(duì)B5菌株的脫硫條件進(jìn)行優(yōu)化，確定脫硫最佳培養(yǎng)基是葡萄糖作碳源、牛肉膏作氮源，最佳接種量為8%，最佳DBT的含量為20mg/L，最佳pH值10、溫度30℃，最佳菌齡3天，裝液量在最少的時(shí)候脫硫效果最好。

脫硫菌；菌株；培養(yǎng)基；優(yōu)化；接種量；脫硫效果

傳統(tǒng)的物理和化學(xué)脫硫方法（HDS）存在著脫硫不完全、成本高和操作費(fèi)用高等缺點(diǎn)[1-2]。相比之下生物脫硫（BDS）技術(shù)具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、設(shè)備投資和操作費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)燃料油深度脫硫最有效的技術(shù)之一[3]。在脫硫微生物篩選過程中，DBT是公認(rèn)的脫有機(jī)硫模式化合物，據(jù)此分離出來的菌種可有效脫出有機(jī)硫，且不破壞C—C結(jié)構(gòu)，從而保留了燃料的熱值[4]

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣本材料取自大慶煉化公司聚合物二廠未被排除的工業(yè)廢水。實(shí)驗(yàn)器材包括壓力蒸汽滅菌鍋（TOMY ES—315），721型紫外分光光度計(jì)，振蕩培養(yǎng)箱（HZQ—F160），超凈工作臺(tái)（VS—1300L—U），離心機(jī)（Allegra64R）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的富集與分離

取10 mL水樣加到90 mL的NB培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min培養(yǎng)3 d后，從中取2.5mL的上清液加到50mLBSM培養(yǎng)基的三角瓶中，相同培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，將菌液制備成梯度稀釋液（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍），逐一標(biāo)記，分別取0.1mL稀釋液加到BSM固體平板上，28～30℃恒溫培養(yǎng)2～3 d至菌落出現(xiàn)。

挑取不同形態(tài)的單菌落采用劃線分離法反復(fù)進(jìn)行分離純化，直到得到單菌株的純培養(yǎng)物，純化菌株保存于LB斜面培養(yǎng)基上，4℃冰箱保存。

1.2.2 菌株降解效果的測(cè)定

挑取單菌落接入裝有5mLNB培養(yǎng)液的試管內(nèi)，30℃，150 r/min搖床培養(yǎng)24 h作為種子液。取lmL種子液接入裝有50mLBSM2培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃，250 r/min搖床培養(yǎng)72 h，用10%的Na2C03溶液將菌種發(fā)酵液調(diào)pH值為8.0，5 000 r/min離心10min除菌體，取上清4mL，加入Gibb’s試劑40μL，混勻，30℃反應(yīng)30min后，測(cè)其在610 nm處吸光度，代入回歸方程測(cè)出2 HBP含量。

1.2.3 脫硫菌脫硫條件的優(yōu)化

（1）培養(yǎng)基的優(yōu)化。以BSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別取5 g/L葡萄糖、2.5 g/L蔗糖、6 mL/L乙醇、8mL/L甘油、4 g/L乙酸鈉和1.2 g/L檸檬酸鈉作為碳源，72 h培養(yǎng)后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算2—HBP含量，確定最適宜的碳源。以最佳碳源作為BSM碳源，分別取2.5 g/L NH4Cl、2 g/L NH4O3、5 g/L KNO3、10 g/L牛肉膏和25 g/L蛋白胨作為氮源，72 h培養(yǎng)后測(cè)定菌體產(chǎn)生2—HBP量，確定最適宜的氮源。

（2）培養(yǎng)條件的優(yōu)化。培養(yǎng)基選取最佳碳源和氮源，以DBT為唯一硫源，以2%、4%、6%、8%、10%的接種量培養(yǎng)72 h。通過測(cè)定菌體產(chǎn)生的2—HBP量確定最佳接種量。在最佳碳源、氮源和接種量的培養(yǎng)基中添加濃度為20、40、60、80和100mg/L的DBT，培養(yǎng)72 h確定最佳的DBT濃度。最佳培養(yǎng)基中設(shè)置6、7、8、9、10不同pH值，培養(yǎng)72 h確定最佳的pH值。設(shè)置20、25、30、35、40℃不同溫度，培養(yǎng)72 h確定最佳溫度。選取冰箱保存的菌株活化培養(yǎng)2、3、4、5天，將不同菌齡的菌分別接種于最佳培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h確定最佳菌齡。設(shè)置不同裝液量，即每個(gè)250mL三角瓶分別裝液體培養(yǎng)基40、50、60和70mL，培養(yǎng)72 h，研究通氣量狀況對(duì)菌體脫硫影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫硫菌的富集與分離

對(duì)煉化公司聚合物二廠工業(yè)廢水進(jìn)行系列稀釋與劃線分離，在BSM平板上得到優(yōu)勢(shì)菌6株，分別為B1～B6。菌落形態(tài)見表1。

表1 菌落形態(tài)特征

2.2 菌株降解效果的測(cè)定

篩選得到的6株菌在以DBT為唯一硫源的BSM2培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)物與Gibb’s試劑在堿性環(huán)境中均可生成藍(lán)色復(fù)合物[5]，證明產(chǎn)物含2—HBP。利用分光光度計(jì)測(cè)出這幾種菌在610 nm處的吸光度，代入回歸方程計(jì)算生成2—HBP量，以判定菌體脫硫能力的高低。通過不同菌株的降解效果對(duì)比可知，菌株B5的2—HBP濃度最高，說明B5脫硫效果最好。

2.3 脫硫菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

碳源分別是葡萄糖、蔗糖、乙醇、乙酸鈉、甘油和檸檬酸鈉時(shí)B5的脫硫情況表明，該菌在幾種碳源作用下均可脫硫，但葡萄糖作碳源時(shí)，菌體脫硫效果最好，最高可產(chǎn)生7.97 mg/L的2—HBP。

從不同氮源對(duì)菌B5脫硫效果可看出，菌體在牛肉膏作氮源時(shí)最高可產(chǎn)生1.56mg/L的2—HBP。

2.3.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

從不同接種量對(duì)菌B5脫硫效果的影響可以看出，接種量小，脫硫效果不好；隨著接種量的增高，脫硫效果有所提高，但接種量達(dá)8%以后，隨著接種量的增加，脫硫效果反而有所下降。接種量大容易造成雜菌污染[6]，因此最佳接種量為8%，可產(chǎn)生2.23mg/L的2—HBP。

從不同DBT濃度對(duì)菌B5脫硫效果的影響可見，濃度為20mg/L時(shí)，B5最高可產(chǎn)生0.973mg/L的2—HBP，顯示這時(shí)脫硫效果最好；隨著DBT濃度的增高，脫硫有所減弱，在80mg/LDBT濃度以后脫硫效果隨著DBT濃度的增加大幅下降，分析可能與脫硫底物抑制物有關(guān)。

從不同pH值對(duì)菌B5脫硫效果的影響可見，脫硫效果在pH值為8時(shí)最好，可生成3.164 12mg/L的2—HBP。

從不同溫度（20、25、30、35、40℃）對(duì)菌株B5脫硫影響可見，溫度太高或太低都不利于菌的脫硫效果；在30℃時(shí)，2—HBP產(chǎn)生量可達(dá)最大值，為4.569mg/L。

從不同菌齡的菌株（2、3、4、5天）對(duì)B5脫硫效果的影響可見，活化3天以后的菌株脫硫效果最好，可產(chǎn)生5.47mg/L的2—HBP。

裝液量的大小主要影響培養(yǎng)過程中的通氣及溶氧情況，從不同裝液量（40、50、60、70mL）對(duì)菌株B5脫硫效果的影響可見，菌株的脫硫效果隨著裝液量的增多而減弱，這與好氧菌培養(yǎng)特點(diǎn)一致。

根據(jù)以上優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，配置以葡萄糖為碳源、牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基，選擇3天菌齡的菌株，按8%比例接種，裝液量40 mL，在pH值為8、溫度30℃的培養(yǎng)條件下研究脫硫狀況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B5菌株在前兩天脫硫效果不好；從第4天起，脫硫效果明顯增強(qiáng)，最高可產(chǎn)生13.12mg/L的2—HBP；但一周以后脫硫效果沒有明顯上升，結(jié)果與優(yōu)化預(yù)期結(jié)果一致。

3 結(jié)論

（1）實(shí)驗(yàn)分離得到6株可降解DBT的脫硫菌，經(jīng)比較確定了B5為高效脫硫菌株，需進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定。

（2）對(duì)B5菌株的脫硫條件進(jìn)行優(yōu)化，確定脫硫最佳培養(yǎng)基是葡萄糖作碳源、牛肉膏作氮源，最佳接種量為8%，最佳DBT的含量為20mg/L，最佳pH值10、溫度30℃，最佳菌齡3天，裝液量在最少的時(shí)候脫硫效果最好。

[1]田曉娟，唐凌天，彭立娥，等．石油脫硫微生物菌株的篩選及鑒定的研究[J]．地學(xué)前緣，2008，15（6）：192-198.

[2]杜長海，馬智，賀巖峰，等．生物催化石油脫硫技術(shù)進(jìn)展[J]．化工進(jìn)展，2002，21（8）：569-571.

[3]馬艷，劉成，鄒少蘭，等．石油微生物脫硫的研究進(jìn)展[J]．工業(yè)微生物，2007，37（2）：57-63.

[4]楊宇，刁夢(mèng)雪，師舞陽．油田土壤中脫除有機(jī)硫菌株的分離與鑒定[J]．生態(tài)環(huán)境，2006，15（5）：1 009-1 013.

[5]張娟，李清雪，陳春燕．高效脫硫菌的篩選及脫硫性能研究[J]．河北建筑科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，23（1）：5-7.

[6]侯影飛，孔瑛，楊金榮，等．石油生物脫硫菌UP—1培養(yǎng)及反應(yīng)條件的優(yōu)化[J]．2005，29（1）：111-115.

（欄目主持楊軍）

10.3969/j.issn.1006-6896.2014.6.003

基金論文：黑龍江省教育廳自然基金項(xiàng)目“大慶油田石油脫硫微生物激勵(lì)研究”（11523001）。