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(1. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150090; 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

磷脂酶A1(PLA1)是Novozymes公司推出的一種微生物來(lái)源的磷脂酶,在2000年和2007年分別申請(qǐng)了世界專(zhuān)利和美國(guó)專(zhuān)利[1 - 2]。PLA1能特異性水解天然磷脂Sn - 1位酰基,保留磷脂Sn - 2位的不飽和脂肪酸[3]。但是PLA1在過(guò)熱或強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的條件下容易失活,而且酶不易回收等缺點(diǎn)都限制了其應(yīng)用范圍。酶的固定化技術(shù)可以相應(yīng)地提高酶的穩(wěn)定性,與游離酶相比,固定化酶對(duì)環(huán)境的抵抗力更強(qiáng)且反應(yīng)更易于控制[4],在食品[5]等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。依據(jù)酶的性質(zhì)和用途,可將酶的固定化方法分為包埋法[6]、吸附法[7]、交聯(lián)法[8]及共價(jià)偶聯(lián)[9]四種。固定化酶的性質(zhì)與載體材料的結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系,因此很多學(xué)者一直致力于對(duì)載體材料的研究[10]。與其它載體材料相比,磁性分子微粒作為固定化載體具有易從反應(yīng)體系中分離和回收、操作簡(jiǎn)便、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn),在生物醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物工程等領(lǐng)域已有著廣泛的應(yīng)用[11 - 14]。

磁性高分子微粒是由磁性物質(zhì)和高分子材料復(fù)合而成,因其同時(shí)具備高分子粒子及磁性粒子的特性,從而使磁性微粒具有很多優(yōu)良特性,可以在其表面結(jié)合多種反應(yīng)性功能基團(tuán)(如 - OH、 - COOH、 - SH2等)或通過(guò)共價(jià)鍵來(lái)結(jié)合酶、細(xì)胞等,可對(duì)外加磁場(chǎng)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的磁響應(yīng)性,進(jìn)行快速運(yùn)動(dòng)或分離。將酶固定在磁性高分子微粒上,可以盡可能的保持其原有的生物活性。因此,本試驗(yàn)將PLA1固定在磁性Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復(fù)合粒子上,通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了最佳的固定化條件,并研究了其在大豆油脫膠中的應(yīng)用以及假性失活磁性固定化PLA1的酶活再生。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

磷脂酶A1(Lactase Ultra A1) 諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復(fù)合粒子 實(shí)驗(yàn)室自制；水化大豆油 哈爾濱惠康食品有限公司,實(shí)測(cè)初始磷含量為202. 1mg/kg；其它試劑 均為分析純。

SC - 3614離心機(jī) 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；752型分光光度計(jì) 日本島津公司；PHS - 3C精密酸度計(jì) 上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司；馬弗爐 南京寶都儀器有限公司；DF - 101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；掃描電鏡(SEM) 上海米離特儀器公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 磁性固定化PLA1的制備 首先將1g的Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復(fù)合粒子置于50mL的磷酸緩沖液(0. 1mol/L,pH7. 0)中浸泡24h,磁分離后將上述浸泡后的載體加入到一定量的含0. 2%的磷脂酶的磷酸緩沖液(0. 1mol/L,pH7. 0)中,同時(shí)在45℃下攪拌反應(yīng)一段時(shí)間,最后磁分離并用磷酸緩沖液(0. 1mol/L,pH7. 0)洗滌得到固定化酶。濾液和洗滌液合并,用來(lái)測(cè)定酶蛋白含量,將所得的固定化酶放置在冰箱內(nèi)4℃下保存。

1. 2. 2 磁性固定化PLA1用于大豆油脫膠 用500mL具塞三角瓶準(zhǔn)確稱(chēng)取300g水化脫膠大豆油,水浴加熱至45℃,加入45%檸檬酸及一定量的4% NaOH溶液混合均勻,加入一定量的去離子水,取一定量的干燥的磁性固定化酶先用去離子水浸泡復(fù)水后,再加入大豆油中,100r/min機(jī)械攪拌,在一定溫度條件下水浴反應(yīng)一段時(shí)間,取樣進(jìn)行磷含量分析[15]。

1. 2. 3 假性失活磁性固定化PLA1的酶活再生 磁性固定化PLA1長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用于大豆油脫膠后,相對(duì)活力下降,此時(shí)的磁性固定化PLA1已不具有對(duì)大豆毛油脫膠的有效活力,稱(chēng)之為假性失活。將清洗收集的假性失活磁性固定化PLA1置于35%的叔丁醇水溶液中,在溫度50℃、超聲波功率80W的條件下浸泡90min,進(jìn)行磁性固定化PLA1的酶活力再生。

1. 2. 4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將在最佳條件下制備的磁性固定化PLA1用于大豆油脫膠中,選取反應(yīng)時(shí)間(A)、反應(yīng)溫度(B)、磁性固定化PLA1添加量(C)和油相起始pH(D)為主要影響因素,進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn),確定最佳反應(yīng)條件。

表1 正交試驗(yàn)水平表Table 1 Orthogonal experiment level table

1. 2. 5 游離磷脂酶A1活力的測(cè)定 具體操作方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[16]。

1. 2. 6 磁性固定化磷脂酶A1活力測(cè)定 稱(chēng)取一定質(zhì)量的經(jīng)干燥后的磁性固定化酶,經(jīng)復(fù)水后,按照1. 2. 5的方法進(jìn)行相應(yīng)的測(cè)定。

1. 2. 7 磁性固定化酶相對(duì)活力的計(jì)算方法

式中：A：每組中所測(cè)活力值,B：該組中最高活力值。

1. 2. 8 磷含量的測(cè)定 取經(jīng)離心后上層油樣約10g,進(jìn)行含磷量分析,參照GB/T 5537 - 1985的方法。

1. 2. 9 數(shù)據(jù)分析 用Origin75進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2. 1 磁性Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復(fù)合粒子固定化PLA1條件的確定

2. 1. 1 酶液的添加量對(duì)固定化效果的影響 在固定化時(shí)間5h、pH 6. 0、酶液添加量分別為8、12、16、20、24、28mL的條件下進(jìn)行固定化,測(cè)定固定化酶的相對(duì)活力,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 酶液添加量對(duì)磷脂酶A1固定化的影響Fig. 1 Effect of enzyme dosage on activity of magnetic immobilized PLA1

由圖1可以看出,磁性Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復(fù)合粒子固定化磷脂酶的相對(duì)活力在一定的固定化條件下,隨著酶液添加量的增加,固定化酶的活力也逐漸增大,酶液添加量達(dá)到20mL后,隨著酶液添加量的再增加,固定化酶的活力反而減小。這是因?yàn)槊溉芤褐写嬖谝欢康碾s蛋白,酶在負(fù)載到載體上的同時(shí),雜蛋白也同樣負(fù)載到載體上,隨著酶液添加量的增加,雜蛋白的量也逐漸增多,從而競(jìng)爭(zhēng)性地與載體上的環(huán)氧基反應(yīng),大量地覆蓋在載體上,抑制了酶蛋白的負(fù)載,使其催化活力降低。

2. 1. 2 pH對(duì)固定化效果的影響 在酶液的添加量20mL、固定化時(shí)間5. 0h、pH分別選取4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0和7. 5的條件下進(jìn)行固定化,測(cè)定固定化酶的相對(duì)活力,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 pH對(duì)磷脂酶A1固定化的影響Fig. 2 Effect of pH on activity of magnetic immobilized PLA1

由圖2可以看出,隨pH增大,酶活力先緩慢上升,當(dāng)pH等于6時(shí)酶活性最高,當(dāng)pH大于6時(shí),酶活力又逐漸降低。原因可能是酶和固定化載體都存在于緩沖液中,緩沖液的pH改變了酶分子和固定化載體的離子化狀態(tài),從而影響酶分子與載體的結(jié)合；另外酶作為一種蛋白質(zhì),當(dāng)溶液pH超出一定值時(shí),微觀結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生變化,從而引起酶變性或失活。因此緩沖液pH是影響載體與酶蛋白結(jié)合的關(guān)鍵因素之一[17]。

2. 1. 3 固定化時(shí)間對(duì)固定化效果的影響 在酶液的添加量20mL、pH6. 0、固定化時(shí)間分別為3、4、5、6、7和8h的條件下進(jìn)行固定化,測(cè)定固定化酶相對(duì)活力,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 固定化時(shí)間對(duì)磷脂酶固定化的影響Fig. 3 Effect of immobilized time on activity of magnetic immobilized PLA1

由圖3可以看出,開(kāi)始固定化時(shí),隨固定化時(shí)間的延長(zhǎng),固定化酶活力增加,5h時(shí)固定化酶活達(dá)到最高值,固定化時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),固定化酶活力反而下降,這是由酶的失活所致。從圖3可看出,5h為最佳固定化時(shí)間。

2. 2 磁性固定化PLA1的表征分析

磁性固定化PLA1的SEM圖如圖4所示。Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復(fù)合粒子的成球性較好,直徑大約在110nm,粒徑均一,這種均勻的分散比較有利于酶的固定化。由于載體是納米級(jí)磁性微粒,粒徑較小,比表面積大,因此可以負(fù)載大量的PLA1,從圖b中可以看出,固定化效果較好,而且磁性固定化PLA1的分散性也較好,有利于其在酶促反應(yīng)中的應(yīng)用。

圖4 磁性固定化PLA1的SEM圖Fig. 4 SEM micrographs of magnetic immobilized PLA1

2. 3 磁性固定化PLA1在大豆油脫膠中的應(yīng)用

按照表1的因素水平,采用正交選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn),確定最佳脫膠條件,正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The orthogonal experiment result

由表2可以看出,油相起始pH對(duì)脫膠效果影響最大,其次是反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、加酶量。最適宜的脫膠條件是A2B2C3D2,即反應(yīng)時(shí)間6h、反應(yīng)溫度55℃、加酶量0. 12g/kg、油相起始pH6. 0。因?yàn)檎槐碇袥](méi)有該組試驗(yàn),所以補(bǔ)做這組試驗(yàn),最后得到的脫膠油中磷含量為12. 5mg/kg。

2. 4 假性失活磁性固定化PLA1的酶活再生研究

磁性固定化PLA1長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用于大豆油脫膠后,大豆油中磷脂酸等分子與磁性固定化PLA1表面氨基酸殘基易發(fā)生酯化結(jié)合,而在磁性固定化PLA1表面形成部分薄膜覆蓋,且在緩沖液中難以清洗掉,造成磁性固定化PLA1活性中心的空間位阻,造成磁性固定化PLA1的假性失活。在超聲波狀態(tài)下利用有機(jī)溶劑可對(duì)假性失活磁性固定化PLA1表面進(jìn)行適當(dāng)清洗,利用超聲波的直進(jìn)流作用和空化作用,能夠打破固液平衡,有助于薄膜從磁性固定化PLA1表面解析下來(lái),解除對(duì)磁酶表面的覆蓋,同時(shí)使假性失活磁性固定化PLA1的酶活再生。

圖5 再生磁性固定化PLA1在脫膠中的應(yīng)用Fig. 5 The useness of regenerated magnetic immobilized PLA1 in degumming

如圖5所示,將再生的磁性固定化PLA1用在大豆油脫膠中,在反應(yīng)16h后,脫膠油磷含量相對(duì)穩(wěn)定,酶相對(duì)活力仍在80%以上,而在第20h脫膠油磷含量明顯上升,并且磁酶相對(duì)活力下降至76. 3%,已不能有效地用于脫膠。因此,再生可以使磁性固定化PLA1的利用時(shí)間延長(zhǎng),降低了大豆油酶法脫膠的生產(chǎn)成本。

3 結(jié)論

以磁性Fe3O4/SiOx - g - P(GMA)復(fù)合粒子為載體,進(jìn)行磷脂酶A1的固定化,以磁性固定化PLA1的相對(duì)活力為指標(biāo),確定了最佳的固定化條件,即酶液添加量20mL、pH6. 0、反應(yīng)時(shí)間5h,在此最佳條件下制得磁性固定化PLA1酶活力最高。將該固定化酶應(yīng)用于大豆油脫膠中,通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳脫膠條件為：反應(yīng)時(shí)間6h,反應(yīng)溫度55℃,加酶量0. 12g/kg,起始油相pH6. 0。在最優(yōu)條件下進(jìn)行脫膠試驗(yàn),測(cè)定脫膠油中的磷含量為12. 5mg/kg,可以有效地水解磷脂,脫膠效果較好。將再生的磁性固定化PLA1再用于大豆油脫膠中,在反應(yīng)16h后,脫膠油中磷含量相對(duì)穩(wěn)定,酶相對(duì)活力仍在80%以上,延長(zhǎng)了磁性固定化磷脂酶A1的利用時(shí)間,降低了大豆油酶法脫膠的生產(chǎn)成本。

[1]Bojdrk,Svendsena,Fuglsangcc,etal. Lipolytic enzyme variants:WO,2000/32758[P]. 2000 - 08 - 06.

[2]Bojdrk,Svendsena,Fuglsangcc,etal. Lipolytic enzyme variants:US Patent,7312062[P]. 2007 - 12 - 25.

[3]謝林云,汪勇,歐仕益,等. 磷脂酶A1催化水解大豆油制備甘油二酯研究(Ⅰ)—水解條件優(yōu)化[J]. 中國(guó)油脂,2008,33(7):37 - 39.

[4]ClarkDS. Can immobilization be exploited to modify enzyme activity[J]. Trends in Biotechnology,1994,12(11):439 - 443.

[5]V R Murty,J Bhat,P K A Muniswaran. Hydrolysis of rice bran oil using an immobilized lipase from Candida rugosa in isooctane[J]. Biotech Lett. ,2004,26:563 - 567.

[6]Sharma R,Chisti Y,Banerjee U C. Production,Purification,characterization,and applications of lipases[J]. Biotechnology Advances,2001,19:627 - 662.

[7]Bahar T,Celebi S S. Characterization of glucoamylase immobilized on magnetic Poly(styrene)partieles[J]. Enzyme and Microbial Technology,1998,23:301 - 304.

[8]Bahar T,Celebi S S. Performance of immobilized glucoamylase in a magnetically st abilized fluidized bed reactor(MSFBR)[J]. Enzyme Microb Technol,2000,26:28 - 33.

[9]Bailey J E,Cho Y K. Immobilization of glucoamylase and glucose oxidase in activated carbon:Effects of particle size and immobilization conditions on enzyme activity and effectiveness[J].Biotechnology and Bioengineering,1983,25:1923 - 1935.

[10]戎志梅. 生物化工新產(chǎn)品與新技術(shù)開(kāi)發(fā)指南[M]. 第二版. 北京：化學(xué)工出版社,2004,216 - 217.

[11]石可瑜,李朝興,何炳林. 磁導(dǎo)向阿霉素 - 羧甲基葡聚糖毫微粒的研究[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2000,17(1)：21 - 24.

[12]任廣智,李振華,何炳林. 磁性殼聚糖微球用于脈激酶的固定化研究[J]. 離子交換與吸附,2000,16(4)：304 - 310.

[13]楊旭,覃軍,陶長(zhǎng)元. 磁性高分子微球[J]. 化學(xué)世界,2005,3:185 - 187.

[14]L V Nikitin,G V Stepanov,L S Mironva,etal. Properties of magnetoelastics synthesized in external magnetic field[J]. J of Magn and Magnetic Mater,2003(258 - 259):468 - 470.

[15]楊博,楊繼國(guó),孟慶博,等. Lecitase Novo用于大豆油脫膠的研究[J]. 中國(guó)油脂,2003,28(9)：19 - 21.

[16]李脈,楊繼國(guó),楊博. 磷脂酶A1酶活測(cè)定方法的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2007,23(8):80 - 82.

[17]尤蓉,帥永堅(jiān). 蒙脫石K - 10吸附固定糖化酶的研究[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2008,4：103 - 106.