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(1 青島大學附屬醫(yī)院關節(jié)外科,山東 青島 266003; 2 青島市市立醫(yī)院腎內科)

目前，股骨頭壞死臨床發(fā)病率越來越高，晚期股骨頭壞死的主要治療方法為髖關節(jié)置換，雖然該技術已較為成熟，但仍存在假體使用年限有限等缺點，因此臨床治療中盡量保留股骨頭很有必要。髓心減壓術是保留股骨頭的手術治療方法之一，可通過減少淤血降低髓內壓力從而促進新生血管形成。近年來，隨著組織工程學和基因工程技術的快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)富含血小板血漿(PRP)含有多種生長因子，可促進新生骨形成[1]；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)可參與調節(jié)細胞生長、繁殖、分化和凋亡，而其主要的生物學作用是誘導骨形成[2]。本實驗應用BMP-4協(xié)同PRP搭載納米羥基磷灰石(Nano-HA)聯(lián)合髓心減壓術修復兔股骨頭壞死，并且通過組織學觀察及骨密度檢測探討其修復股骨頭壞死的可行性?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 股骨頭壞死模型的制備及分組

健康6月齡新西蘭大白兔40只，體質量2～3 kg，雌雄不限，每周2次臀肌注射醋酸潑尼松龍，每次8 mg/kg,連續(xù)6周,制備股骨頭壞死模型。同時，每周2次肌肉注射青霉素鈉4萬單位以預防感染。模型制備成功后取36只大白兔，隨機分為A、B、C共3組，每組12只，在相同條件下飼養(yǎng)。

1.2 含PRP與BMP-4活性Nano-HA材料的制備

①采用低密度兩次離心法制備PRP：使用裝有100 g/L枸櫞酸鈉溶液0.5 mL的注射器從兔耳中央動脈采集血液，將其搖勻，分別以2 400 r/min離心10 min、3 600 r/min離心15 min, 制備PRP后置-70 ℃冰箱凍存。 ②將80 mg粉末狀BMP-4 溶于2 mL無菌生理鹽水中，并加入PRP 0.6 mL制備混合溶液, 混勻，將Nano-HA材料浸泡于該溶液中混合塑形，然后于真空凍干機中凍干48 h，60Co輻照消毒，無菌封裝，備用。

1.3 實驗方法

B組和C組大白兔耳緣靜脈麻醉后，股骨頭區(qū)域常規(guī)消毒，鋪無菌單，切開皮膚，暴露股骨頭，用直徑約3 mm的鉆頭從股骨頸后內側向股骨頭內鉆入3 mm行髓心減壓術，B組髓心減壓術后逐層縫合，關閉切口；C組髓心減壓術后植入一約3 mm×3 mm×3 mm大小、含PRP與BMP-4的Nano-HA，縫合關閉切口。術后連續(xù)3 d肌注青霉素(每天20萬單位)預防感染。A組不做任何處理。

1.4 觀察指標

1.4.1一般情況 實驗期間觀察大白兔進食、活動、切口愈合等一般情況。

1.4.2組織學觀察 術后2、4、8周每組均處死3只兔，切取股骨頭，沿冠狀面剖開，置于40 g/L 多聚甲醛溶液中固定,脫鈣液脫鈣，石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色, 光鏡下觀察新骨形成情況。

1.4.3骨小梁圖像分析 取B、C組術后2、4、8周股骨頭切片， 100倍顯微鏡下取5個視野，應用圖像分析系統(tǒng)測定骨小梁占骨缺損面積比例，取平均值。

1.4.4骨密度測定 術后8周切取3只兔股骨頭，應用單光子骨密度測量儀測量股骨頭骨密度，測量位置為股骨頭冠狀面中部，測3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 各組大白兔一般情況

術后2 d各組大白兔進食均較少，精神狀況較差，2 d后進食逐漸增加至正常水平，活動增加。3組大白兔切口均愈合良好，未見明顯炎性反應。

2.2 各組組織學觀察

A組：術后2周，大量骨細胞及骨髓組織壞死，髓腔中充滿壞死的組織碎片，骨小梁壞死、斷裂，可見大量骨陷窩；術后4周，缺損邊緣可見少量新生骨及纖維肉芽組織；術后8周，周邊有骨組織形成，中心為纖維組織，無骨組織充填。B組：術后2周，骨缺損區(qū)可見少量炎性細胞，缺損邊緣可見成骨細胞，并有少量骨小梁出現(xiàn)；術后4周，骨缺損邊緣區(qū)成骨細胞及骨小梁增多；術后8周，缺損邊緣逐漸形成骨壁，缺損區(qū)仍然在修復，可見大量的骨髓組織。C組:術后2周，骨缺損區(qū)充滿大量的成骨細胞，邊緣區(qū)可見新生骨小梁；術后4周，股骨頭內大量骨小梁形成，骨小梁表面有成骨細胞覆蓋，小梁間新生毛細血管豐富；術后8周，骨缺損區(qū)基本消失，可見大量成熟的骨小梁充填其中，骨髓組織形成。

2.3 B組、C組骨小梁占缺損區(qū)面積比例比較

術后2、4、8周，C組骨小梁占缺損區(qū)面積比例均高于B組，差異有顯著性(t=2.459～2.949,P<0.05)。見表1。

表1 B組、C組術后各時間點骨小梁占缺損區(qū)面積比例

2.4 各組骨密度比較

術后8周，A、B、C組骨密度分別為(0.334±0.024)、(0.388±0.021)、(0.445±0.032)g/cm2，C組骨密度高于A組和B組，B組高于A組，差異均有顯著性(F=13.655,P<0.05)。

3 討 論

目前,股骨頭壞死已經(jīng)成為臨床中較為常見的疾病，股骨頭一旦壞死，難以自身修復，這主要與其自身血液循環(huán)較少、新骨形成緩慢但骨小梁吸收過快等有關。因此，促進新生血管與新骨形成是早期股骨頭壞死治療的關鍵。本文組織學觀察結果顯示，B組4周及8周時具有一定的骨小梁修復骨壞死及促進新生骨形成的能力，其基本原理是通過降低股骨頭內壓力，延緩骨壞死進展，刺激周圍血管形成，從而提高股骨頭的血流量以改善血液循環(huán),增強骨修復時的爬行替代，較快修復壞死灶。目前，髓心減壓術治療股骨頭壞死已經(jīng)被證實有效、可靠[3]。本文研究結果顯示，B組雖然進行了髓心減壓，組織學觀察顯示也有骨小梁的修復及新生骨的形成，但由于股骨頭壞死區(qū)周圍缺乏促進骨修復的生長因子，導致股骨頭修復不完全。本實驗C組同時將含PRP與 BMP-4的Nano-HA植入髓心減壓后的壞死股骨頭中，組織學觀察表明術后4周即有明顯的成骨反應，并有明顯的新生骨形成；術后8周組織學觀察及骨密度檢測結果表明，C組的骨修復能力明顯好于B組，認為與PRP及BMP的骨誘導作用及良好的支架材料對兩種生長因子的理想搭載有關。

隨著組織工程技術的發(fā)展，PRP促進骨缺損修復正逐漸成為研究熱點，PRP在骨缺損的修復治療方面取得了很好的效果[4]。PRP能增強體內成骨愈合，其機制可能為：活化血小板釋放多種生長因子,如血小板源生長因子(PDGF)、類胰島素生長因子(IGF)、轉移生長因子-β(TGF-β) 等[5]，其中PDGF能促進細胞的有絲分裂，促進新生血管形成[6]；IGF可調整成骨細胞與破骨細胞的分化[7]；TGF-β能誘導成骨細胞分化、促進新骨形成[8]。PRP中含有的各種生長因子符合人體的比例，因此成為臨床應用中的理想生長因子來源。BMP是目前已知的確定具有骨誘導功能的生長因子[9]。關于BMP在骨形成中的作用機制主要集中在以下兩個方面：①募集間充質細胞并誘導其向成骨細胞分化；②聯(lián)合其他生長因子共同參與骨組織的形成[10]。有研究結果顯示，BMP的作用與距離呈反比，當骨缺損超過一定范圍時，機體自身的BMP已經(jīng)難以起到誘導骨形成的功能，因此適當補充外源性的BMP十分必要。隨著組織工程技術的發(fā)展，人們已經(jīng)研制出了活性高、成本低的BMP,這使得外源性BMP的來源問題得到了解決。

PRP與BMP本身無固定與支撐功能，植入體內骨缺損部位后容易被擴散稀釋或吸收降解，難以持久地在骨缺損處發(fā)揮作用。因此，尋找一種生物相容性較好的材料一直是材料學與臨床醫(yī)學領域的一項重大研究任務。本文組織學研究結果顯示，Nano-HA具有良好的生物活性，具有誘導成骨活性的能力，新生的組織中含有促進骨形成的生長因子及具有成骨潛能的細胞，而且該材料具有較高的比表面積，容易吸收，在新骨形成的同時逐漸降解[11]，并被新生的骨組織替代。其具有的多孔結構使得成骨細胞生長時容易爬行附著，骨缺損的爬行替代過程縮短，并能夠為新生血管及生長因子提供附著支撐。同時，本文組織學觀察未見明顯炎性反應，說明Nano-HA有良好的生物相容性。已有研究結果證實，Nano-HA對細胞無毒性，是一種理想的骨移植替代材料[12]。

本文研究結合了組織工程治療與外科治療的優(yōu)點，應用髓心減壓術減輕骨內高壓與靜脈淤血，促進了股骨頭的血液循環(huán)；通過生長因子的植入，提高了骨修復的能力，加速了骨的形成過程，這為臨床上早期股骨頭壞死的治療提供了新的思路。但本文研究中也有一些需要進一步研究的地方，如無法證實生長因子的濃度與骨誘導的關系。希望今后能對此進行研究并確定生長因子作用的最佳濃度。

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