孫宇，封瑞，孫威，胡慧媛，郝麗英

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理教研室，沈陽110001）

變性再復(fù)性方法提取高純度Cav1.2片段GST-CT1及其生物活性的鑒定

孫宇，封瑞，孫威，胡慧媛，郝麗英

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理教研室，沈陽110001）

目的探尋誘導(dǎo)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）與Cav1.2鈣通道片段CT1重組的易形成包涵體的大分子融合蛋白的提取與純化的方法。方法在E.coliBL21中轉(zhuǎn)化入pGEX-6p-3/CT1重組質(zhì)粒并誘導(dǎo)表達(dá)，采用GST包涵體變性復(fù)性試劑盒和非離子去污劑B-PER分離純化GST-CT1融合蛋白，用Pull down assay方法鑒定GST-CT1融合蛋白及其生物活性。結(jié)果應(yīng)用GST包涵體變性復(fù)性試劑盒和非離子去污劑B-PER能夠分離得到高純度的易形成包涵體的GST-CT1融合蛋白，且分離純化的GST-CT1融合蛋白具有與鈣調(diào)蛋白結(jié)合的生物活性。結(jié)論操作簡易的GST包涵體變性復(fù)性法能夠針對(duì)易形成包涵體的GST-CT1融合蛋白進(jìn)行分離和純化，且得到的蛋白具有生物學(xué)活性。

包涵體；變性再復(fù)性；鈣離子通道

心肌細(xì)胞L型電壓依賴性鈣離子通道（L-type voltage-dependent calcium channel，LTCC）是鈣離子（Ca2+）進(jìn)入心肌細(xì)胞的主要途徑，在維持細(xì)胞Ca2+平衡中起著至關(guān)重要的作用［1，2］。在生理情況下，LTCC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流在心肌細(xì)胞興奮收縮耦聯(lián)、鈣觸發(fā)鈣釋放及動(dòng)作電位形成等過程中發(fā)揮著重要作用，另外，還參與可興奮細(xì)胞神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、釋放和自我調(diào)控轉(zhuǎn)錄［3～6］。心肌細(xì)胞LTCC調(diào)節(jié)的失衡會(huì)引發(fā)心律失常、心房顫動(dòng)和心力衰竭等一系列病理過程。近年來，研究者對(duì)心肌LTCC的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了廣泛深入的研究。研究表明，LTCC可以被蛋白激酶A（proteinkinase A，PKA）、鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）、鈣結(jié)合蛋白1（Ca2+-bingding protein 1，CaBP1）、鈣蛋白酶抑素（calpastatin，CS）、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡ，CaMKⅡ）等多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)［7～11］。LTCC的C末端CT1（a.a.1509～1789）上有磷酸化和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，PKA能夠通過CT1上的磷酸化位點(diǎn)使LTCC磷酸化，從而對(duì)心肌細(xì)胞LTCC進(jìn)行調(diào)節(jié)；CaM、CaBP1、CS、CaMKⅡ等蛋白能夠直接或間接與CT1上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而對(duì)LTCC進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此獲得CT1片段對(duì)于研究LTCC具有重要的意義。

大腸埃希菌因其具有操作簡單、成本低、生長快、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于重組蛋白的表達(dá)。GST標(biāo)簽的CT1重組蛋白（GST-CT1）在經(jīng)大腸埃希菌誘導(dǎo)大量表達(dá)的情況下，通常會(huì)形成無活性的包涵體，在蛋白質(zhì)提取純化的過程中以難溶狀態(tài)存在，大大降低了重組蛋白提取的產(chǎn)量。目前，包涵體形成的原因并不十分清楚，可能是易形成包涵體的蛋白部分錯(cuò)誤折疊而導(dǎo)致。目前，針對(duì)包涵體蛋白的提取方法主要有親和層析法、變性法等方法，上述方法因具有耗時(shí)、規(guī)模大、出現(xiàn)不可逆的變性等缺點(diǎn)而不能廣泛應(yīng)用。因此，本研究擬采用技術(shù)簡單、操作方便的B-PER破膜［12］，并針對(duì)GST-CT1蛋白提取純化過程中易形成包涵體這一難題，運(yùn)用包涵體變性再復(fù)性試劑盒有效地提取純化高純度、高產(chǎn)量的GST-CT1蛋白，并運(yùn)用pull-down assay鑒定GST-CT1及其生物學(xué)活性。為今后LTCC的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體pGEX-6p-3和BL21菌種購自Amersham Pharmacia Biotech公司。B-PER購自Thermo Scientic公司，蛋白酶抑制劑購自Roche Applied Science公司，氨芐西林（ampicillin sodium）、IPTG、溶菌酶（lysozyme）、DTT均購自Wako公司，Glutathione-Sepharose 4B beads、PreScission Protease、Turbo Nuclease購自GE Healthcare公司，GST包涵體變性試劑盒（Rapid GST inclusion body solubilization and renaturation kit）購自Cell Biolabs，INC公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pGEX-6p-3/CT1的誘導(dǎo)及表達(dá)：將重組質(zhì)粒pGEX-6p-3/CT1轉(zhuǎn)化到BL21中，于含有0.1 mg/mL氨芐西林（AMP）的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃、100 r/min震蕩過夜。將菌液稀釋至OD值0.6～0.8之間，再加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃、100 r/min震蕩5 h，誘導(dǎo)表達(dá)GST-CT1。

1.2.2 變性再復(fù)性方法提取與純化GST-CT1：6 000 r/min離心菌液15 min，收集沉淀。將沉淀重懸［每克沉淀加入4 mL B-PER，0.2 mg/mL溶菌酶（lysozyme），1 μL DNA酶（Turbo nuclease）和蛋白酶抑制劑］，室溫振蕩孵育30 min以促進(jìn)細(xì)菌破膜、DNA溶解及GST-CT1蛋白的釋放。16 000 r/min離心20 min，將上清置于冰上，留取少量標(biāo)記為S，剩余的上清用300 μL STE緩沖液洗過的GS-4B beads 4℃孵育過夜。取少許沉淀，用Tris溶解標(biāo)記為P。將S、P分別經(jīng)1×loading緩沖液處理，80℃加熱5 min，經(jīng)12.5%SDS-PAGE電泳（上樣量均為10 μg），以確定此時(shí)GST-CT1是主要存在于上清或沉淀中。

將上述離心后的沉淀用變性復(fù)性試劑盒的20 mL 1×STE緩沖液，1 mmol/L DTT，0.2 mg/mL溶菌酶和蛋白酶抑制劑重懸，加入變性試劑，4℃搖晃1 h，使錯(cuò)誤折疊的包涵體蛋白結(jié)構(gòu)打開而變?yōu)樗苄?。再加入?fù)性試劑，使GST-CT1按照正確的方式折疊而以可溶的形式存在。加入STE緩沖液洗過的300 μL GS-4B beads，4℃孵育過夜。將上清提取的GST-CT1與變性再復(fù)性方法提取的GST-CT1分別800 r/min離心3 min，棄上清。依次用5 mL PBS和Tris各洗2次，用含有蛋白酶抑制劑的Tris buffer稀釋，4℃保存。牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，Bradford法測蛋白濃度。

1.2.3 變性再復(fù)性方法提取純化的GST-CT1蛋白及純度的鑒定：取上述方法制備的GST-CT1蛋白，經(jīng)1×loading緩沖液處理后，80℃加熱5 min，進(jìn)行12.5%SDS-PAGE電泳（上樣量均為10 μg），根據(jù)Marker檢測CT1蛋白。

1.2.4 pull down assay鑒定GST-CT1蛋白生物學(xué)活性：檢測當(dāng)CaM的濃度分別為0.1、0.3、1、3和10 μmol/L時(shí)GST-CT1與CaM的結(jié)合情況。每400 μL體系包含10 μg GST-CT1蛋白，2 mmol/L CaCl2，蛋白酶抑制劑，不同濃度的CaM，溶于Tris buffer中。4℃搖晃孵育3 h。將孵育好的樣品用含0.05% Tween-20、蛋白酶抑制劑和2 mmol/L CaCl2的Tris緩沖液500 μL洗2次后，用1×loading緩沖液處理，室溫靜置20 min，80℃加熱5 min。12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，按照CaM濃度由低到高的順序依次上樣?？捡R斯亮藍(lán)染膠1 h后，脫色液脫色，照相。應(yīng)用Image J軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 GST-CT1蛋白提取純化過程中以不可溶的包涵體形式存在于沉淀之中

將B-PER破膜處理的菌液離心后的上清S和沉淀P（各10 μg）分別進(jìn)行12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，可見GST-CT1大部分存在于沉淀之中（圖1）。說明GST-CT1作為大分子蛋白，在提取純化過程中以不可溶的包涵體形式存在于沉淀中，上清中雖然也存在GST-CT1蛋白，但與沉淀相比所含有的GST-CT1蛋白含量非常少。

2.2 經(jīng)變性再復(fù)性方法提取純化的GST-CT1蛋白

采用變性再復(fù)性方法提取的GST-CT1蛋白及破膜離心后的上清提取的GST-CT1蛋白進(jìn)行12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳（上樣量10 μg），考馬斯亮藍(lán)染色。如圖2所示：經(jīng)變性再復(fù)性方法提取純化的GST-CT1蛋白產(chǎn)量明顯提高，且此方法提取的GSTCT1蛋白雜帶較少，純度較高。上清液中提取的GST-CT1蛋白非常少，且主要為GST蛋白。說明用該方法提取的GST-CT1蛋白遺失率少，能夠盡可能多地將菌液中的GST-CT1提取出來。由此可見，變性再復(fù)性方法能夠提取出高濃度、高產(chǎn)率、高純度的GST-CT1蛋白。

圖1 GST-CT1蛋白的存在位置Fig.1 Location of the GST-CT1

2.3 經(jīng)變性再復(fù)性試劑盒方法提取的GST-CT1蛋白生物活性的鑒定

圖2 經(jīng)變性再復(fù)性方法提取的GST-CT1蛋白Fig.2 Purification of GST-CT1 by denaturation and renaturation method

將變性再復(fù)性試劑盒方法提取的GST-CT1蛋白，與不同濃度的CaM蛋白孵育，進(jìn)行12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳（GST-CT1上樣量10 μg），經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、灰度值分析后，結(jié)果如圖3所示：用變性復(fù)性方法提取的GST-CT1蛋白能夠與CaM濃度依賴性的結(jié)合，表明GST-CT1具有正常的生物學(xué)活性。

圖3 GST-CT1蛋白與CaM呈濃度依賴性結(jié)合Fig.3 GST-CT1 bind to CaM in concentration dependent manner

3 討論

隨著心肌LTCC研究的不斷深入，CT1片段在LTCC調(diào)節(jié)過程中的重要性逐漸被人們所發(fā)現(xiàn)。CT1除了能與CaM、CaBP1、CS及CaMKII等經(jīng)典的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合外，最新研究表明三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）在豚鼠心肌細(xì)胞中也能以濃度依賴的方式與CT1片段結(jié)合從而對(duì)LTCC進(jìn)行調(diào)節(jié)，并且這種結(jié)合也呈Ca2+和CaM依賴性［13］。CT1不僅能夠與各種調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合而改變LTCC的活性，而且H2O2和H2S等氧化還原劑也能夠改變CT1片段上氨基酸殘基的氧化還原狀態(tài)，從而對(duì)LTCC的活性做出調(diào)節(jié)［1，14］。可見CT1片段在LTCC的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

GST-CT1易形成包涵體而以難溶的形式存在，因此較難提取純化出高純度、高產(chǎn)量蛋白，對(duì)于這一難題目前尚無良好的解決方法。變性方法作為一種改進(jìn)方法，被應(yīng)用于提取純化GST-CT1蛋白，應(yīng)用十二烷基肌胺酸鈉（N-lauroylsarcosine sodium salt）陰離子表面活性劑作為變性劑，打開錯(cuò)誤折疊的GST-CT1蛋白而使其以可溶形式存在，從而提高蛋白產(chǎn)量。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于提取出的蛋白濃度、純度都相對(duì)較高，且經(jīng)濟(jì)成本較低、適合大規(guī)模生產(chǎn)操作［12，15］。變性劑雖然能打開錯(cuò)誤折疊的GSTCT1蛋白結(jié)構(gòu)而使其變?yōu)榭扇?，但是被打開的蛋白質(zhì)失去了其原有的空間結(jié)構(gòu)，在變性條件去除的情況下，GST-CT1蛋白會(huì)進(jìn)行緩慢的自然復(fù)性過程，但是這一復(fù)性效率很低，不能完全恢復(fù)其原有的正?？臻g結(jié)構(gòu)，因此會(huì)在一定程度上影響蛋白質(zhì)的生物活性。

鑒于上述變性法的局限性，本研究在變性的基礎(chǔ)上又對(duì)蛋白進(jìn)行了復(fù)性，即應(yīng)用變性再復(fù)性方法提取純化GST-CT1蛋白。運(yùn)用試劑盒中的變性試劑對(duì)形成包涵體的GST-CT1蛋白進(jìn)行變性修飾，將錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)打開而變?yōu)榫€性可溶形式，隨后又應(yīng)用試劑盒中的復(fù)性試劑將變性后的GST-CT1蛋白按照正確的方式折疊恢復(fù)其正常的空間結(jié)構(gòu)，在提取純化過程中以可溶形式存在，大大提高了GST-CT1蛋白產(chǎn)量。本研究方法通過尿素等小分子添加劑阻止蛋白的聚集，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的活性，使不正確折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，而向正確的方向進(jìn)行折疊，可大幅度提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率。該方法提取的蛋白不僅濃度高、純度高、產(chǎn)率高，且pull-down方法顯示該GST-CT1蛋白能夠與CaM濃度依賴性的結(jié)合，具有正常的生物學(xué)活性。

綜上所述，本研究方法操作簡單、省時(shí)，而且沒有pH值的變化和氧化還原對(duì)的參與，為LTCC的研究奠定了基礎(chǔ)。雖然該方法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)成本投入較高。因此，在實(shí)驗(yàn)研究中，應(yīng)該根據(jù)具體需要選擇合適的蛋白提取純化方法。

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（編輯 王又冬）

The Method ofDenaturation and Renaturation for Purifying CT1 FragmentofCav1.2 and the Identification ofIts Biologic Activity

SUNYu，F(xiàn)ENGRui，SUNWei，HUHui-yuan，HAOLi-ying
（DepartmentofPharmaceuticalToxicology，SchoolofPharmacy，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore methods for the extraction and purification of the inclusion body of fusion protein of glutathione transferase（GST）and CT1 fragment of Cav1.2，and to investigate its biologic activity.MethodsPGEX-6p-3 recombinant plasmid was transfected intoE.coliBL21 to express.GST-CT1 fusion protein with GSTinclusion body waspurified by solubilization and renaturation kitand B-PER.The biologic activity of GST-CT1 fusion protein was identified by pull down assay.ResultsThe GST-CT1 fusion protein，which is easy to form inclusion body，was successfully purified by the established method and pull down assay showed that the purified protein can bind to calmodulin protein.ConclusionThe GST-CT1 fusion protein was successfully purified by denaturation and renaturation method and also showed its normalbiologic activity.

inclusion body；denaturation and renaturation；calcium channel

R96

A

0258-4646（2014）09-0777-04

國家自然科學(xué)基金（31071004，81100108）

孫宇（1989-），女，碩士研究生.

郝麗英，E-mail：haoliying2006@163.com

2014-06-04

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：