王波，汲坤，張麗艷，尚德志，侯君妍，華正偉

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院病理科，內(nèi)蒙古民族大學(xué)分子病理學(xué)研究所，內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古牙克石022150；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110034；3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院頜面外科，沈陽(yáng)110034；4.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2011級(jí)口腔醫(yī)學(xué)，沈陽(yáng)110034）

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78和基質(zhì)金屬蛋白酶在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)

王波1，汲坤2，張麗艷2，尚德志3，侯君妍4，華正偉4

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院病理科，內(nèi)蒙古民族大學(xué)分子病理學(xué)研究所，內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古牙克石022150；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110034；3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院頜面外科，沈陽(yáng)110034；4.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2011級(jí)口腔醫(yī)學(xué)，沈陽(yáng)110034）

目的探討葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義，闡明GRP78在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)26例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和10例正?？谇唤M織中GRP78蛋白的表達(dá)；采用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)正?？谇唤M織和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78mRNA的表達(dá)；采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)26例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)。結(jié)果GRP78蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為100%（26/26），在正?？谇唤M織中的陽(yáng)性表達(dá)率為20%（2/10），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與高分化和中分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織比較，低分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的GRP78蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度明顯增高（P＜0.05）。與正?？谇唤M織比較，GRP78mRNA表達(dá)水平在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)增高（P＜0.05）。MMP-2和MMP-9蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均為100%（26/26）。結(jié)論GRP78和MMPs在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯升高，提示口腔鱗狀細(xì)胞癌中GRP78蛋白的表達(dá)可能與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

口腔鱗狀細(xì)胞癌；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；基質(zhì)金屬蛋白酶

口腔癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的3%左右［1］，其中90%為鱗狀細(xì)胞癌。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成、分泌的一種蛋白質(zhì)，屬于熱休克蛋白70家族。近年來(lái)隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)GRP78除了駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中起到分子伴侶的作用外，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，甚至分泌到細(xì)胞外，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞生存、血管形成等重要生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，是一種多功能的蛋白質(zhì)［2］。GRP78在正常成人腦、肺臟、心臟器官有基礎(chǔ)水平的低表達(dá)［3］，在腫瘤組織中卻高表達(dá)。有研究表明，GRP78與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。然而有關(guān)口腔鱗狀細(xì)胞癌中GRP78的表達(dá)及其與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)關(guān)系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78的表達(dá)，闡明GRP78與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)本資料：26例口腔鱗狀細(xì)胞癌石蠟標(biāo)本和10例正?？谇唤M織石蠟標(biāo)本。26例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織為2008年1月至2013年12月內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院收治的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的癌組織標(biāo)本，10例正?？谇唤M織取自活檢組織，組織切片均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。其中男性26例，女性10例，年齡48～79歲，平均年齡63歲。26例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本按照腫瘤病理學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷并分級(jí)：高分化10例，中分化8例，低分化8例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)：組織標(biāo)本常規(guī)10%甲醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，浸入二甲苯透明，常規(guī)浸蠟，包埋，切片，行免疫組織化學(xué)染色。兔抗人GRP78、MMP-2和MMP-9抗體購(gòu)自中國(guó)BOSTER，羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗和DAB顯色劑購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。顯微鏡下觀察口腔組織細(xì)胞質(zhì)中GRP78、MMP-2和MMP-9的表達(dá)情況，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)棕染顆粒多少和染色的強(qiáng)弱，將表達(dá)強(qiáng)度分為不表達(dá)（-）、弱陽(yáng)性表達(dá)（+）及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（++）。判定方法如下：每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野。按著色面積百分?jǐn)?shù)計(jì)分：0分，＜10%；1分，10%～40%；2分，40%～70%；3分，＞70%。按著色強(qiáng)度計(jì)分：0分，無(wú)著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色。兩者相乘：0分，為陰性（-）；1～3分，為弱陽(yáng)性（+）；4分以上，為強(qiáng)陽(yáng)性（++）。

1.2.2 RT-PCR：取液氮中保存的正?？谇唤M織和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織各50 mg，勻漿，按總RNA提取按試劑盒說(shuō)明書操作，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，分別用GRP78及GAPDH的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，30個(gè)循環(huán)后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，采用天能凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。GAPDH引物序列如下：上游引物5′-GGTGATGCTGGTG CTGAGTATGT-3′，下游引物5′-AAGAATGGGAGTT GCTGTTGAAGTC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度617 bp。GRP78引物序列如下：上游引物5′-GATAATCAACC AACTGTTAC-3′，下游引物5′-GTATCCTCTTCACCA GTTGG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度578 bp。引物上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，口腔鱗狀細(xì)胞癌組織與正常口腔組織GRP78和MMPs表達(dá)比較采用Fisher′s Exact檢驗(yàn)，口腔鱗狀細(xì)胞癌組織與正常口腔組織GRP78mRNA表達(dá)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GRP78蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和正常口腔組織中的表達(dá)

通過(guò)對(duì)36例口腔組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析，我們發(fā)現(xiàn)GRP78蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。GRP78蛋白在10例正?？谇唤M織中陽(yáng)性表達(dá)率為20%（2/10），在26例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中均成陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為100%（26/26），見(jiàn)圖1?？谇击[狀細(xì)胞癌組織與正常口腔組織比較GRP78陽(yáng)性表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

圖1 正?？谇唤M織和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78的表達(dá)×40Fig.1 Immunohistochemical analysis of GRP78 expression in normal oral tissue and oral squamous cell carcinoma tissues×40

2.2 不同病理分級(jí)的口腔鱗狀細(xì)胞癌中GRP78的表達(dá)水平

口腔鱗狀細(xì)胞癌病理分級(jí)為高分化的病例中GRP78強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率為30%（3/10），中分化病例為50%（4/8），低分化病例為87.5%（7/8）。各病理分級(jí)間GRP78強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示GRP78的表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌的病理分級(jí)有關(guān)，其表達(dá)隨著病理分級(jí)的增加而下降。

2.3 正?？谇唤M織和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78mRNA的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，與正?？谇唤M織（0.33± 0.025）比較，高分化（0.68±0.017）、中分化（0.79± 0.026）、低分化（0.99±0.013）口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78mRNA表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與高分化、中分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織比較，低分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78mRNA表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 半定量RT-PCR檢測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78 mRNA的表達(dá)水平Fig.2 Semi-quantitative RT-PCR analysis of GRP78 mRNA in normal oral tissue and oral squamous cell carcinoma tissue

2.4 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

通過(guò)對(duì)26例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織MMP-2蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)MMP-2蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。MMP-2蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中均成陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為100%（26/26），見(jiàn)圖3。

圖3 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP-2的表達(dá)×40Fig.3 Immunohistochemical analysis of MMP-2 expression in oral squamous cell carcinoma tissues×40

2.5 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-9蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

通過(guò)對(duì)26例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織MMP-9蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)MMP-9蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。MMP-9蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中均成陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為100%（26/26），見(jiàn)圖4。

圖4 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP-9的表達(dá)×40Fig.4 Immunohistochemical analysis of MMP-9 expression in oral squamous cell carcinoma tissues×40

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，展開(kāi)或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在凋亡和癌變過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用［4］。分子伴侶蛋白GRP78是1977年在無(wú)葡萄糖介質(zhì)中培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞的過(guò)程中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種分子量為78 kDa的蛋白，又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，是熱休克蛋白70家族中高度保守的成員之一，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激［5］。人類GRP78基因定位在9號(hào)染色體q33-q34.1上，主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。在生理情況下，GRP78通過(guò)膜傳感器維持滅活狀態(tài)［6］。未折疊蛋白可使GRP78活化和觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)，GRP78由生理性應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生［7］，在胚胎發(fā)育期間表達(dá)［8］。在細(xì)胞周期早期，GRP78在胚胎細(xì)胞增殖和保護(hù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)抵抗凋亡方面發(fā)揮重要作用［9］。GRP78過(guò)表達(dá)與多種人類腫瘤的侵襲相關(guān)，包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和胃癌等［10］。GRP78和腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)表現(xiàn)在GRP78在腫瘤的轉(zhuǎn)移細(xì)胞株和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞株表達(dá)增加，敲除GRP78可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和腫瘤異種移植模型中腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［11］。在乳腺癌、肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和胃癌患者，GRP78表達(dá)增高與腫瘤病理級(jí)別、復(fù)發(fā)和患者生存質(zhì)量相關(guān)［12］。有研究表明GRP78通過(guò)PTEN和Akt信號(hào)通路參與了癌癥的發(fā)展和生存優(yōu)勢(shì)［13］。作為細(xì)胞膜蛋白的GRP78還通過(guò)MAPK/ PI3K和Smad2/3信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲［14］。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和正?？谇唤M織中GRP78蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明了GRP78蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)顯著升高，其表達(dá)強(qiáng)度與口腔鱗狀細(xì)胞癌的病理分級(jí)有關(guān)，隨著腫瘤病理分級(jí)的增加而下降。GRP78mRNA表達(dá)在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)也顯著高于正?？谇唤M織，且低分化的口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78mRNA表達(dá)高于中分化和高分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2和MMP-9蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)均成陽(yáng)性。上述結(jié)果表明了GRP78和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2和MMP-9蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中均成陽(yáng)性表達(dá)，提示GRP78蛋白可能在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。GRP78與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展的具體機(jī)制尚未明確，我們?cè)诤笃谘芯恐袑⑦M(jìn)一步證實(shí)。

［1］Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，2011：the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（4）：212-236.

［2］Arap MA，Lahdenranta J，Mintz PJ，et al.Cell surface expression of the stress response chaperone GRP78 enables tumor targeting by circulating ligands［J］.Cancer Cell，2004，6（3）：275-284.

［3］Ni M，Lee AS.ER chaperones in mammalian development and human diseases［J］.FEBS Lett，2007，581（19）：3641-3651.

［4］Ma Y，Hendershot LM.ER chaperone functions during normal and stress conditions［J］.J Chem Neuroanat，2004，28（1-2）：51-65.

［5］Lee AS.The glucose-regulated proteins：stress induction and clinical applications［J］.Trends Biochem Sci，2001，26（8）：504-510.

［6］Credle JJ，F(xiàn)iner-Moore JS，Papa FR，et al.On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic reticulum［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（52）：18773-18784.

［7］Liu G，Shang Y，Yu Y.Induced endoplasmic reticulum（ER）stress and binding of over-expressed ER specific chaperone GRP78/BiP with dimerized epidermal growth factor receptor in mammalian cells exposed to low concentration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine［J］.Mutat Res，2006，596（1-2）：12-21.

［8］Mao C，Tai WC，Bai Y，et al.In vivo regulation of Grp78/BiP transcription in the embryonic heart：role of the endoplasmic reticulum stress response element and GATA-4［J］.J Biol Chem，2006，281（13）：8877-8887.

［9］Luo S，Mao C，Lee B，et al.GRP78/BiP is required for cell proliferation and protecting the inner cell mass from apoptosis during early mouse embryonic development［J］.Mol Cell Biol，2006，26（15）：5688-5697.

［10］Lee AS.GRP78 induction in cancer：therapeutic and prognostic implications［J］.Cancer Res，2007，67（8）：3496-3499.

［11］Jamora C，Dennert G，Lee AS.Inhibition of tumor progression by suppression of stress protein GRP78/BiP induction in fibrosarcoma B/C10ME［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（15）：7690-7694.

［12］Fu Y，Lee AS.Glucose regulated proteins in cancer progression，drug resistance and immunotherapy［J］.Cancer Biol Ther，2006，5（7）：741-744.

［13］Fu Y，Wey S，Wang M，et al.Pten null prostate tumorigenesis and AKT activation are blocked by targeted knockout of ER chaperone GRP78/BiP in prostate epithelium［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（49）：19444-19449.

［14］Kelber JA，Panopoulos AD，Shani G，et al.Blockade of Cripto binding to cell surface GRP78 inhibits oncogenic Cripto signaling via MAPK/PI3K and Smad2/3 pathways［J］.Oncogene，2009，28（24）：2324-2336.

（編輯 陳姜）

Expression of Glucose Regulated Protein 78 and Matrix Metalloproteinasesin OralSquamous CellCarcinoma

WANGBo1，JIKun2，ZHANGLi-yan2，SHANGDe-zhi3，HOUJun-yan4，HUAZheng-wei4
（1.Department of Pathology，The Second Clinical Medical School of Inner Mongolia University for the Nationalities，Molecular Pathological Research Institute of Inner Mongolia University for Nationalities，Department of Pathology，Inner Mongolia Forestry General Hospital，Yakeshi 022150，China；2.Department of Pathophysiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；3.Department of Maxillofacial Surgery，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；4.Grade 2011 OralMedicine，Shenyang MedicalCollege，Shenyang110034，China）

ObjectiveTo explore the expression and significance of glucose regulated protein 78（GRP78）and matrix metalloproteinases（MMPs）in human oralsquamous cellcarcinoma，and clarify the effectofGRP78in the process oforalsquamouscellcarcinoma.MethodsThe expression of GRP78，MMP-2 and MMP-9 were evaluated by immunohistochemistry in 26 oral squamous cell carcinoma tissues.RT-PCR was performed to detect the mRNA levels ofGRP78in oral squamous cell carcinoma tissues.ResultsThe results of immunohistochemistry indicated that the positive rates of GRP78 were 100%and 20%in oral squamous cell carcinoma tissues and normal oral tissues，and the difference was significant（P＜0.01）.Compared with well differentiated and moderately differentiated oral squamous cell carcinoma tissues，the positive rates of GRP78 protein in poorly differentiated oral squamous cell carcinoma tissues were obvious higher（P＜0.05）.Compared with normal oral tissues，the expression ofGRP78mRNA in oral squamous cell carcinoma tissues was significantly increased（P＜0.05）.Compared with well differentiated and moderately differentiated oral squamous cell carcinoma tissues，the expression ofGRP78mRNA in poorly differentiated was significantly increased（P＜0.05）. The positive expression of MMP-2 and MMP-9 were 100%in oral squamous cell carcinoma tissues.ConclusionThe expression ofGRP78and MMPs were obviously increased in oral squamous cell carcinoma tissue.The expression of GRP78 may plays an important role in the development and progression oforalsquamouscellcarcinoma.

oral squamous cell carcinoma；glucose regulated protein 78；matrix metallopreteinases

R739.8

A

0258-4646（2014）09-0786-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81260310）；遼寧省博士科研啟動(dòng)基金（20111126）

王波（1976-），男，副主任醫(yī)師，博士.

汲坤，E-mail：jikun0629@gmail.com

2014-06-13

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：