褚達明，王丹波，李妍，劉巋然

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中BRAF基因的表達及意義

褚達明，王丹波，李妍，劉巋然

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

目的探討B(tài)RAF基因在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中的表達。方法采用實時聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)及免疫組織化學(xué)SP法檢測20例子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜及20例對照組正常子宮內(nèi)膜中BRAF的表達。結(jié)果在位內(nèi)膜中BRAFmRNA相對表達量（0.000 067 897 0±0.000 114 528 6）明顯高于正常內(nèi)膜（0.000 009 543 1±0.000 006 454 3）（P＜0.05），而異位內(nèi)膜（0.000 029 395 7±0.000 038 046 9）與在位內(nèi)膜之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中BRAF蛋白的陽性表達率和表達強度均明顯高于正常內(nèi)膜（P＜0.05），而異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜之間陽性表達率及表達強度的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論在位內(nèi)膜BRAF基因高表達可能在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中起重要作用，而與病情進展的相關(guān)性有待進一步驗證。

子宮內(nèi)膜異位癥；BRAF；子宮內(nèi)膜；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)；免疫組化

子宮內(nèi)膜異位癥是一種多病因引起的慢性炎性疾病，其特征為具有生長功能的子宮內(nèi)膜（腺體和間質(zhì)）組織出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外部位［1］。該病常發(fā)生于生育年齡的婦女，發(fā)病率為10%～20%。慢性盆腔痛、不孕及包塊是其主要臨床特點。其病因及發(fā)病機制至今尚未完全闡明，造成治療上的困難。目前研究認為子宮內(nèi)膜異位癥是一種病因復(fù)雜的多基因遺傳的疾病［2］。我們選擇了本課題組前期通過cDNA代表差異性分析技術(shù)篩查出的子宮內(nèi)膜異位癥差異性高表達基因之一的BRAF基因［3］，應(yīng)用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)及免疫組織化學(xué)法檢測其在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中的表達，為子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選擇2013年1月至12月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科行開腹或腹腔鏡手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜異位癥患者20例為實驗組，手術(shù)同時行全子宮切除術(shù)，病理學(xué)診斷結(jié)果證實為子宮內(nèi)膜異位癥，術(shù)后立即留取異位病灶和在位內(nèi)膜。對照組為同期無子宮內(nèi)膜異位癥的正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本20例。研究對象年齡23～50歲，實驗組年齡（36.9±8.7）歲，對照組年齡（38.5±6.4）歲（P＞0.05），具有可比性。全部病例無其他內(nèi)分泌、免疫及代謝性疾病，手術(shù)前3個月內(nèi)未接受激素治療。根據(jù)月經(jīng)周期及病理確認標(biāo)本均為分泌期留取。所有標(biāo)本分為兩部分，一部分放入10%甲醛中固定用來做免疫組化，另一部分放入液氮中冷凍用來做RT-PCR。實驗經(jīng)本院倫理委員會審批通過，均簽署知情同意書。

1.2 RT-PCR檢測BRAFmRNA表達

嚴(yán)格按照TaKaRa公司的RNA提取試劑盒（TrizolTMRNA Isolation Reagent）中的說明書進行操作，從每份冷凍標(biāo)本中提取總RNA。使用Prime-Script?第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA第一鏈，并在-20℃下保存用來進一步擴增。按操作說明使用TaKaRa公司的SYBR?PrimeScriptTMreal-time PCR試劑盒進行RT-PCR反應(yīng)。應(yīng)用Primer 5.0軟件，參照BRAF基因序列設(shè)計特異引物，上游引物為5′-GGCAGAGTGCCTCAAAAAGAA-3′，下游引物為5′-AACCAGCCCGATTCAAGGA-3′，以18 s基因作為內(nèi)部對照。使用LightCycler?2.0 RT-PCR系統(tǒng)進行45個循環(huán)的2步法擴增，即95℃20 s，60℃1 min。實驗結(jié)果分析采用相對定量方法，即BRAFmRNA的相對表達量=2-ΔCt，ΔCt=CtBRAF基因-Ct對照基因。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測BRFA蛋白表達

免疫組化采用SP法，石蠟包埋標(biāo)本，4 μm厚切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。一抗為兔抗人BRAF多克隆抗體（美國Signalway Antibody），用免疫組化SP試劑盒（福州邁新）檢測BRAF蛋白的表達。將組織切片放入檸檬酸鹽緩沖劑中加熱至沸騰，持續(xù)5 min，進行抗原修復(fù)，后加入1%H2O2阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，隨后在室溫下加入5%的正常羊血清工作液封閉30 min，后加入抗原濃度為1∶200的一抗，4℃冰箱過夜，后滴加生物素標(biāo)記二抗，在室溫下作用30 min，再滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液作用20 min，DAB染色20 s，蘇木素復(fù)染。以PBS液置換一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：細胞質(zhì)染色，出現(xiàn)棕褐色、棕黃色或淡黃色顆粒為陽性染色。根據(jù)細胞染色強度和染色細胞所占面積積分之和進行判斷。染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。染色面積評分標(biāo)準(zhǔn)：無細胞染色為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，≥50%為3分。兩種評分相加，0～1分為（-），2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++）。陽性表達率=（+～+++級的例數(shù)/各組總例數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析取得結(jié)果，計量資料多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，計數(shù)資料多組間陽性率比較采用χ2檢驗，等級資料多組間表達強度比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜BRAFmRNA表達

以18s基因作為內(nèi)部對照，子宮內(nèi)膜異位癥組異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜BRAFmRNA表達量分別為0.000 029 395 7±0.000 038 046 9及0.000 067 897 0± 0.000 114 528 6，二者比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；對照組正常內(nèi)膜表達量為0.000 009 543 1± 0.000 006 454 3，與子宮內(nèi)膜異位癥組在位內(nèi)膜比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中BRAF mRNA相對表達量Fig.1 Relative expression of BRAF mRNA in ectopic，eutopic endometrium of endometriosis

2.2 子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜BRAF蛋白表達

BRAF蛋白免疫組織化學(xué)染色情況：陽性反應(yīng)物呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要表達在子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和間質(zhì)細胞的胞質(zhì)內(nèi)。BRAF蛋白在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜中均有表達，其陽性表達率分為為55%（11/20）、60%（12/20）和10%（2/ 20）。如圖2所示，BRAF在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜胞質(zhì)內(nèi)大量表達，可見棕黃色染色顆粒，呈陽性反應(yīng)。BRAF在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜胞質(zhì)內(nèi)大量表達，可見棕褐色染色顆粒，呈強陽性反應(yīng)。BRAF在正常分泌期子宮內(nèi)膜胞質(zhì)內(nèi)少量表達，可見淡黃色染色顆粒，呈弱陽性反應(yīng)。子宮內(nèi)膜異位癥組異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜中BRAF蛋白的陽性表達率及表達強度均無明顯差異（P＞0.05）。而異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜分別與對照組正常內(nèi)膜比較，陽性表達率及表達強度均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見圖3。

圖2 免疫組化SP法檢測子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中BRAF蛋白的表達×400Fig.3 The expression of BRAF protein measured by immunohistochemistry in ectopic，eutopic endometrium of endometriosis×400

圖3 BRAF蛋白在各組內(nèi)膜中的表達強度構(gòu)成Fig.3 The proportion of BRAF protein in groups

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性的炎性疾病，是育齡婦女的常見病和多發(fā)病，與不孕和慢性盆腔痛關(guān)系密切，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重影響患者的生殖健康和生活質(zhì)量。盡管有眾多解釋子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的學(xué)說，但最被廣為接受的是子宮內(nèi)膜種植學(xué)說，即月經(jīng)期經(jīng)血逆流，子宮內(nèi)膜細胞和碎片隨經(jīng)血逆流至腹腔，進而種植于卵巢和盆腔腹膜，形成子宮內(nèi)膜異位癥病灶［4］。然而，經(jīng)血逆流在育齡期婦女中的發(fā)生率約為70%～80%，而子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率只有10%～15%，這說明子宮內(nèi)膜的侵襲性種植是一個多因素參與的復(fù)雜過程。

越來越多的證據(jù)表明子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜存在內(nèi)源性異常，使其易于遷徙和種植，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展［5，6］。而內(nèi)膜的侵襲性種植涉及多條信號傳導(dǎo)通路的相互協(xié)調(diào)，其中有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路起到重要作用［2］。MAPK是各細胞信息從細胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞核的重要傳遞者，是刺激細胞增殖、生存、分化的交匯點或共同通路。其變更會導(dǎo)致信號傳導(dǎo)的不平衡，引起細胞增殖失控。已有研究證實，在多種人類腫瘤組織及腫瘤細胞系中，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常表達或異常活化，提示該通路調(diào)控異常，與腫瘤關(guān)系密切［7］。2004年Yoshino等［8］闡述了MAPK通路與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系。認為MAPK通路能夠影響多種細胞因子的表達和功能，其上調(diào)對子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜的生長和種植起到重要作用［9，10］。

BRAF基因，全名為鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源體B1，是1988年由Ikawa等［11］首先在人類尤文氏肉瘤中發(fā)現(xiàn)并克隆確認的，是一個能轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞且有活性的DNA序列，與ARAF和CRAF（RAF-1）同屬RAF家族，是一種癌基因，其編碼的BRAF蛋白為MAPK激酶的激酶［12］，是MAPK激酶家族里最高效的磷酸化劑，它位于MAPK通路入口處，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡。BRAF突變后持續(xù)性激活MAPK通路，使前有絲分裂原有效分裂能力增強，導(dǎo)致細胞異常增殖和分化。自Davies等［13］報道約66%的惡性黑色素瘤和15%的結(jié)腸癌中BRAF基因存在體細胞錯義突變后，該基因與腫瘤關(guān)系的研究漸成熱點。本課題組通過cDNA代表差異性分析技術(shù)篩查出BRAF基因為子宮內(nèi)膜異位癥差異性高表達基因之一［3］，但其在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達尚不清楚。Yotova等［14］研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜中BRAF基因水平相似，但在位內(nèi)膜中BRAF基因的活化率高于正常子宮內(nèi)膜，從而使MAPK信號通路被異常激活，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶持續(xù)活化，導(dǎo)致在位內(nèi)膜細胞高速增殖。故即使在相同的外部刺激和環(huán)境下，在位內(nèi)膜更易增殖、遷徙。

本研究也顯示，子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜中BRAFmRNA相對表達量、BRAF蛋白陽性表達率及表達強度均明顯高于正常內(nèi)膜，證明子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜BRAF基因表達及活性均明顯強于正常內(nèi)膜，與Yotova等［14］的研究結(jié)果相似，因此有理由推測，子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜中BRAF基因的活化率增高，進而使其轉(zhuǎn)錄的mRNA水平增高，高水平的BRAFmRNA又使其編碼的BRAF蛋白高表達，從而持續(xù)激活MAPK信號通路，使在位內(nèi)膜細胞生長和分化調(diào)節(jié)失控，從而導(dǎo)致在位內(nèi)膜細胞更易增殖、遷徙，形成子宮內(nèi)膜異位癥。BRAF基因有可能是MAPK信號通路上游調(diào)控基因之一，在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中起重要作用，有待進一步驗證。在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中，BRAF基因是否在其病情進展中持續(xù)發(fā)揮作用，目前少見報道。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥組異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較，BRAFmRNA表達及蛋白陽性表達率及表達強度均無差異，似與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)展無關(guān)，但子宮內(nèi)膜異位癥病變廣泛性、病理多態(tài)性特點［1］導(dǎo)致異位病灶中異位內(nèi)膜細胞含量不確定因素可能是影響本研究結(jié)果的因素之一，有待進一步擴大樣本量、增加細胞模型及動物模型等多層次深入研究。

綜上所述，本研究檢測了BRAF在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達情況及表達部位，其在異位及在位內(nèi)膜中的高表達與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生相關(guān)，證明BRAF基因在在位內(nèi)膜的高表達是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制之一，而其在病情進展中的作用及其進一步的多層次研究及機制研究值得關(guān)注。

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（編輯 陳姜）

Expression and Significance of BRAF Gene in Ectopic Endometrium ofWomen with Endometriosis

CHUDa-ming，WANGDan-bo，LIYan，LIUKui-ran
（DepartmentofObstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the expression ofBRAFin ectopic and eutopic endometrium ofwomen with endometriosis.MethodsQuantitative real-time polymerase chain reaction（RT-PCR）and immunohistochemistry SP method were adopted to measure theBRAFexpression in ectopic and eutopic endometrium（n=20）ofpatientswith endometriosis，as wellas normalendometrium（n=20）ofwomen withoutendometriosis.Re?sultsRelative expression ofBRAFmRNA in eutopic endometrium（0.000 067 897 0±0.000 114 528 6）was significantly higher than that in control group（0.000 009 543 1±0.000 006 454 3）（P＜0.05），but no difference was found between the ectopic（0.000 029 395 7±0.000 038 046 9）and eutopic group（P＞0.05）.The expression rate and intensity of BRAF in ectopic and eutopic endometrium was significantly higher than the control group（P＜0.05）；however，there was no significant difference between ectopic and eutopic endometrium（P＞0.05）.ConclusionThe high expression ofBRAFin eutopic endometrium may play a crucial role in the occurrence of endometriosis，while the correlation with disease progression needsto be furtherverified.

endometriosis；BRAF；endometrium；quantitative real-time polymerase chain reaction；immunohistochemistry

R711.71

A

0258-4646（2014）09-0790-04

國家自然科學(xué)基金（81070467，81270675）；“盛京自由研究者”基金（201204）

褚達明（1985-），男，醫(yī)師，碩士.

王丹波，E-mail：wangdb@sj-hospital.org

2014-06-18

網(wǎng)絡(luò)出版時間：