蔣 鵬 趙春貴 楊素萍

(華僑大學(xué)生物工程與技術(shù)系 廈門 361021)

集約化、高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖的迅速發(fā)展, 水體殘餌、藥物、代謝和排泄物及其它有機(jī)物的滯留和沉積,以及養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化和有害污染物(如: 銨氮亞硝氮硫化氫H2S和藥物殘留等)的積累等(Díazet al, 2012; Coreyet al, 2013), 導(dǎo)致水生態(tài)環(huán)境破壞, 嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展(Burfordet al, 2001; Yusoffet al, 2011)。因此, 盡快去除養(yǎng)殖水體中等有毒有害物質(zhì), 恢復(fù)水體微生態(tài)平衡, 是解決水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展的關(guān)鍵問題(Zhouet al, 2009)。微生物修復(fù)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè), 在養(yǎng)殖水體的凈化和養(yǎng)殖疾病的控制等方面發(fā)揮著重要作用, 但微生物在利用和轉(zhuǎn)化有機(jī)物的過程中, 能夠產(chǎn)生小分子有機(jī)物(如: 糖類、有機(jī)酸、醇、肽類、氨基酸等), 從而引起水體溶解氧和pH值變化, 對(duì)水體微生物種群的生長代謝產(chǎn)生明顯影響。因此, 復(fù)雜多樣的養(yǎng)殖水體環(huán)境勢(shì)必影響微生物制劑功效, 研究小分子有機(jī)物對(duì)微生物制劑功效的影響, 對(duì)微生物制劑的合理使用具有重要的指導(dǎo)意義。

不產(chǎn)氧光合細(xì)菌(APB)已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)(Qiet al, 2009), 其代謝方式靈活多樣, 能夠利用異養(yǎng)微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)物(糖、酸和醇)、H2S及氨等合成細(xì)胞自身物質(zhì)。APB不僅可作為餌料, 也可抑制水體病原菌生長, 增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物的抗病能力, 甚至能有效去除水體中等有害物質(zhì)。目前, 關(guān)于APB對(duì)去除特性及其環(huán)境因素的研究已有較多報(bào)道, 如: 光、氧、鹽度和pH對(duì)Rhodopseudomonas palustris2-8菌株去除能力的影響(陳燕紅等, 2010); 在為氮源的體系中, 不同碳源對(duì)Rhodobacter sphaeroidesP4菌株去除的能力的影響(俞吉安等, 2000),以及對(duì)4種紫色非硫細(xì)菌分別去除能力影響(邱宏端等, 1999)。一般來說, 在適宜菌體生長的光、氧、溫度、pH、鹽度和碳源等條件下, 菌體對(duì)均具有良好的去除能力, 但不同菌株對(duì)無機(jī)三態(tài)氮(和硝氮的去除能力有很大差異, 再者研究所用體系起始濃度較低, 較難反映出現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)菌株的最大去除潛力。特別是在無機(jī)三態(tài)氮共存的海水體系中, 小分子有機(jī)物對(duì)APB菌株去除高濃度無機(jī)三態(tài)氮影響的研究鮮有報(bào)道, 尤其是對(duì)有機(jī)氮化物影響的報(bào)道更為少見。

現(xiàn)有研究表明, 有機(jī)氮存在時(shí),Bacillus megateriumX2和Bacillussp. LY等芽孢桿菌去除水體的能力明顯降低, 甚至使水體濃度升高(侯穎等,2006; 何霞等, 2007)。研究顯示, APB也具有氨化作用, 能夠?qū)⒂袡C(jī)氮化物轉(zhuǎn)化為氨, 但在有機(jī)氮源存在時(shí), APB對(duì)水體無機(jī)三態(tài)氮去除能力究竟如何目前還不是很清楚。本文從福建泉州洛陽橋紅樹林環(huán)境中分離獲得一株海洋著色菌(Marichromatium gracile)YL28菌株(趙江艷等, 2011), 前期研究表明, 該菌株不僅能很好地去除水體中的高濃度硫化物, 而且能以為唯一氮源生長, 并對(duì)有很高的耐受能力和去除能力(蔣鵬等, 2013), 本文在適宜(光照、厭氧、溫度、鹽度和pH)的條件下, 在高濃度無機(jī)三態(tài)氮共存的模擬海水水體中, 著重研究了小分子有機(jī)碳源(葡萄糖、乙酸鈉和乙醇)、有機(jī)氮(蛋白胨和尿素)和水體pH對(duì)該菌株生長和去除無機(jī)三態(tài)氮過程的影響, 并從海水養(yǎng)殖場(chǎng)排水口取樣, 在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步觀察了該菌株對(duì)養(yǎng)殖水體無機(jī)三態(tài)氮的去除能力。本研究考察了該菌株同時(shí)脫除水體無機(jī)三態(tài)氮的潛力,也為APB制劑的環(huán)境適應(yīng)性和合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種: 海洋著色菌(Marichromatium gracile)YL28菌株, 其16S rRNA基因GenBank登錄號(hào)為JF719917, 本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保藏(趙江艷等, 2011)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基和菌種懸液的制備 菌種培養(yǎng)基:采用改良的Pfennig(1988)紫色硫細(xì)菌無機(jī)選擇性培養(yǎng)基(Trüperet al, 1992), 以2.0g/L無水乙酸鈉為碳源,以0.12g/L Na2S2O3取代0.36g/L Na2S·9H2O, 鹽度(NaCl)為3, pH值為7.0。無碳源和氮源的培養(yǎng)基配制:刪去菌種培養(yǎng)基中的碳源和氮源, 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求添加碳源和無機(jī)三態(tài)氮即為模擬海水水體。菌種懸液的制備: 將菌種接種于菌種培養(yǎng)基中, 接種量為5%(v/v), 接種后用無菌的菌種培養(yǎng)基充滿培養(yǎng)瓶, 于最適條件((28±1)°C、3000lx光照厭氧)(趙江艷等, 2011)培養(yǎng)5d, 8000r/min離心10min收集菌體, 用無菌超純水洗滌3次, 懸浮菌體制備菌種懸液。

1.2.2 測(cè)定體系和培養(yǎng)條件 取菌種懸液, 按5%(v/v)接種量, 分別接種到以乙酸鈉(2.00g/L)、葡萄糖(4.69g/L)和乙醇(1.12mL/L)為唯一碳源(相當(dāng)于體系中乙酸鈉的含碳量), 無機(jī)三態(tài)氮共存的模擬海水水體中, 測(cè)定不同有機(jī)碳源對(duì)菌體生長和無機(jī)三態(tài)氮去除的影響。以乙酸鈉(2.00g/L)為唯一碳源, 按5%(v/v)接種量, 分別接種到添加有①蛋白胨、②蛋白胨和無機(jī)三態(tài)氮、③尿素、④尿素和無機(jī)三態(tài)氮4種不同氮源的模擬海水水體中, 其中尿素和蛋白胨中的含量分別為0.24g/L和0.14g/L(氮含量近似), 用于測(cè)定有機(jī)氮源對(duì)菌體生長和無機(jī)三態(tài)氮去除的影響。在以乙酸鈉(2.00g/L)為碳源、無機(jī)三態(tài)氮共存的模擬海水體系中, 設(shè)定其pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0, 按5%(v/v)接種量接種后用于測(cè)定pH對(duì)菌體生長和無機(jī)三態(tài)氮去除的影響。每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)重復(fù), (28±1)°C、3000lux光照厭氧培養(yǎng), 充氮?dú)馊?測(cè)定三氮含量、菌體生物量和水體pH。

1.2.3 菌株YL28對(duì)實(shí)際海水養(yǎng)殖廢水中無機(jī)三態(tài)氮的去除效率 從福建廈門集美區(qū)集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖試驗(yàn)場(chǎng)取水樣, 室溫靜置12h, 取樣測(cè)定初始無機(jī)三態(tài)氮含量, 并分裝到培養(yǎng)瓶中。接種后取水樣補(bǔ)滿培養(yǎng)瓶, 起始菌體生物量(OD660)為0.07, 總?cè)莘e為560mL。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù), (28±1)°C、3000lux光照厭氧培養(yǎng), 培養(yǎng)過程中取樣測(cè)定三態(tài)氮含量, 設(shè)置未接種水樣為對(duì)照組。

1.2.4 生物量和pH測(cè)定 采用比濁法測(cè)定菌體生物量, 在光程為1cm比色杯中, 于UV-3200PCS紫外可見分光光度計(jì)(MAPADA)上, 測(cè)定660nm下的光密度(OD660), 即用OD660表示菌體生物量。用pH計(jì)(DELTA 320型, Mettler-Toled)測(cè)定樣品的pH值。

1.2.5 無機(jī)三態(tài)氮的測(cè)定和計(jì)算 無機(jī)三態(tài)氮的含量均以氮素的含量計(jì)算, 重復(fù)測(cè)定3次。測(cè)定采用Nessler's試劑分光光度法;測(cè)定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法;測(cè)定采用紫外分光光度法(APHA, 1998)。按公式r=Ct?C0和R=(Ct?C0)/C0×100%分別計(jì)算無機(jī)氮的去除量(r)和去除率(R), 式中C0和Ct分別表示無機(jī)三態(tài)氮的初始濃度和測(cè)定時(shí)的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)菌株生長和高濃度無機(jī)三態(tài)氮去除的影響

在不同碳源中, YL28菌株對(duì)模擬水體中無機(jī)三態(tài)氮的去除能力如圖1所示。結(jié)果表明: 隨著處理時(shí)間延長, 模擬水體中的的去除率增大, 菌體生物量和pH值升高, 并逐漸趨于穩(wěn)定。在處理過程中, 模擬水體中的含量均出現(xiàn)暫時(shí)升高的現(xiàn)象, 與乙醇相比, 葡萄糖和乙酸鈉為碳源時(shí)無機(jī)三態(tài)氮的去除速率較高。菌體生長速率和生物量與水體pH值變化呈正相關(guān), 生物量高, 則水體pH值高, 菌體生物量和生長速率由高到低排列的碳源順序?yàn)橐宜徕c、葡萄糖和乙醇。以葡萄糖、乙酸鈉和乙醇為碳源時(shí), 處理6.5d, 菌體對(duì)260.05mg/L的去除率分別為93.40%、84.55%和66.63%,80.50mg/L和100.06mg/L均能被完全去除。3種碳源中, 乙酸鈉中的菌體生長最佳, 其菌體生物量(OD660)達(dá)1.9; 葡萄糖為碳源時(shí),的去除能力最高。由此可見, 在含有高濃度無機(jī)三態(tài)氮的模擬水體中, YL28菌株能夠良好地生長。在葡萄糖、乙酸鈉或乙醇為唯一碳源的模擬水體中, 該菌株均能有效地去除高濃度的無機(jī)三態(tài)氮; 碳源不同, 菌體生長和去除無機(jī)三態(tài)氮的能力有差異, 且在無機(jī)三態(tài)氮去除過程中能夠產(chǎn)生暫時(shí)積累, 隨著處理時(shí)間的延長, YL28菌株均能有效地去除模擬水體中的

圖1 碳源對(duì)無機(jī)三態(tài)氮共存水體中 (c)的去除率、菌體生物量(OD600, d)和pH值(e)的影響Fig.1 Effects of carbon source on removal of ammonium (a), nitrite (b), nitrate (c), bacterial growth (OD600, d) and pH (e) in seawater simulated in high concentration of inorganic nitrogen

2.2 有機(jī)氮對(duì)菌株生長和高濃度無機(jī)三態(tài)氮去除的影響

在含蛋白胨或尿素的模擬水體中添加無機(jī)三態(tài)氮, 對(duì)模擬水體中菌體生長、水體pH值和無機(jī)三態(tài)氮去除的影響如圖2和圖3所示。在蛋白胨、蛋白胨和無機(jī)三態(tài)氮、尿素、尿素和無機(jī)三態(tài)氮4組氮源的模擬水體中, 隨YL28處理時(shí)間延長, 菌體生物量和水體pH值逐漸增加, 但培養(yǎng)結(jié)束時(shí), 菌體生物量(OD660)在0.27—0.37間, 水體pH值在8.4—9.2間, 與乙酸鈉為唯一碳源的無機(jī)三態(tài)氮模擬水體生長相比(圖4d), 在含蛋白胨或尿素的模擬水體中, 菌體的生物量明顯降低。

YL28菌株在處理以蛋白胨或尿素為唯一氮源的模擬水體過程中, 能夠通過氨化作用降解蛋白胨或尿素產(chǎn)生的大量和少量而未能檢測(cè)到的產(chǎn)生(圖3a, c)。處理1d時(shí), 水體中含量最高, 隨著時(shí)間進(jìn)一步延長,的含量逐漸降低, 蛋白胨降解產(chǎn)生的最終幾乎被完全去除, 而尿素降解的不能被完全去除,52.70%殘留在水體中。蛋白胨或尿素的模擬水體中,添加無機(jī)三態(tài)氮, 隨著時(shí)間的延長, 水體中逐漸降低, 處理6.5d, 降低80%以上; 處理1d時(shí),有所升高, 然后逐漸降低,很快被完全去除, 而則不能被完全去除。因此, 環(huán)境水體中含有高濃度蛋白胨或尿素等有機(jī)氮化物時(shí), 由于菌體具有氨化作用, 使水體中含量升高, 表觀上呈現(xiàn)菌體去除的能力降低,甚至水體中含量升高, 但該菌株仍表現(xiàn)出良好的的去除能力。

圖2 有機(jī)氮對(duì)菌體生物量(OD600, a)和水體pH值(b)的影響Fig.2 Effects of organic nitrogen sources on bacterial growth (OD600, a) and pH (b) in simulated seawater

圖3 不同氮源對(duì)模擬水體中的去除影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on removal of ammonium (□), nitrite (▲), nitrate (○) in simulated seawater

圖4 pH對(duì)無機(jī)三態(tài)氮共存水體中的去除率、菌體生物量(OD600, d)和pH(e)的影響Fig.4 Effects of pH on removal of ammonium (a), nitrite (b), nitrate (c), bacterial growth (OD600, d) and pH (e)

2.3 pH對(duì)菌體生長和高濃度無機(jī)三態(tài)氮去除的影響

在不同pH的模擬水體中, YL28菌株對(duì)模擬水體中的無機(jī)三態(tài)氮的去除及其菌體生長如圖4所示, 模擬水體中的菌體生物量和水體pH值升高, 無機(jī)三態(tài)氮去除率升高, 并逐漸趨于平衡, 水體處理過程中呈現(xiàn)出含量暫時(shí)升高的現(xiàn)象。起始pH值為7.0時(shí), 菌體的生長速率和最終生物量最高, 最大生物量(OD660)約為2.1。起始pH值為6.0—9.0時(shí), 菌體對(duì)水體中均具有良好的去除能力, 其中能被完全去除; 而pH對(duì)的去除影響較大, pH=6.0時(shí),的去除率最高, 去除率可達(dá)100%; pH=8.0時(shí)去除率可達(dá)60%。起始pH=5.0時(shí), 雖然菌體生長很差, 但對(duì)具有一定的去除能力, 對(duì)則去除能力很差, 去除率僅為7%。

2.4 對(duì)實(shí)際海水養(yǎng)殖廢水無機(jī)三態(tài)氮去除

以不添加菌的樣品為對(duì)照, YL28菌株異位處理實(shí)際海水養(yǎng)殖水體過程中的含量變化如圖5所示。結(jié)果表明: YL28菌株對(duì)實(shí)際海水養(yǎng)殖水體樣品中的均具有良好的去除效果。處理結(jié)束時(shí), 與對(duì)照組相比,含量明顯降低,被完全去除, 而對(duì)照組則均有殘留,殘留更高。在處理過程中, 雖然水體暫時(shí)性地積累但又被很快除去。最大積累量為0.28mg/L, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于水體中的去除量, 表明該菌株具有硝化作用,能夠?qū)⑥D(zhuǎn)化為究竟是否如此, 尚需要進(jìn)一步證明。

圖5 YL28對(duì)海水養(yǎng)殖水體中 (c)的去除率的變化Fig.5 Changes in the removal of ammonium (a), nitrite (b), and nitrate (c) in mariculture water by stain YL28

3 討論

APB能夠利用異養(yǎng)微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)物(糖、酸和醇)、H2S及氨等合成細(xì)胞自身物質(zhì), 有效去除水體中等有害物質(zhì), 已被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖水體有害污染物的凈化(王芳等,2010; 鄭卉等, 2012)。模擬水體實(shí)驗(yàn)研究表明, 不同菌株對(duì)無機(jī)三態(tài)氮的去除能力表現(xiàn)出很大差異; 利用不同的碳源, 菌株對(duì)無機(jī)三態(tài)氮的去除能力也表現(xiàn)出很大差異, 如: 醋酸鹽對(duì)莢膜紅桿菌(Rhodobacter capsulatus)去除的能力有促進(jìn)效果(邱宏端等, 1999), 葡萄糖能降低Rhodobactersp.S(劉雙江等, 1995)和Rhodobacter sphaeroidesP4(俞吉安等, 2000)對(duì)的去除能力。而本研究的特色是在無機(jī)三態(tài)氮共存的模擬體系中探討了YL28菌株對(duì)無機(jī)三態(tài)氮的去除能力及其受小分子有機(jī)氮源和碳源的影響。研究結(jié)果表明, YL28菌株能良好地去除無機(jī)三態(tài)氮, 尤其是對(duì)有很高的耐受能力和去除能力, 與文獻(xiàn)報(bào)道的APB菌株相比, 該菌株是耐受和去除能力最高的菌株之一(蔣鵬等,2013)。在適宜條件下, 可完全去除水體中高達(dá)80.50mg/L表明該菌株具有去除實(shí)際水體三態(tài)無機(jī)氮的能力, 尤其是去除的應(yīng)用潛力。由于該菌株對(duì)無機(jī)三態(tài)氮的去除能力較高, 在實(shí)際應(yīng)用時(shí)可減少制劑的用量, 從而降低使用成本。在小分子有機(jī)碳源存在時(shí), 該菌株均能有效地去除水體高濃度無機(jī)三態(tài)氮, 尤其具有高效去除和的能力; 而在有機(jī)氮化物(尿素和蛋白胨)存在時(shí), 該菌株對(duì)高濃度無機(jī)三態(tài)氮體系中的去除能力影響明顯, 但對(duì)的去除能力影響不大。通常情況下, 養(yǎng)殖水體中中不但三態(tài)無機(jī)氮共存, 也存在糖類、酸類、醇類、肽類和氨基酸等多種多樣的有機(jī)化合物。因此, 揭示水體有機(jī)化合物對(duì)APB去除無機(jī)三態(tài)氮的規(guī)律, 對(duì)于開發(fā)高效的微生物制劑以及制劑的合理應(yīng)用都具有重要的指導(dǎo)意義。

王 芳, 李 筠, 盛 軍等, 2010. 一株光合細(xì)菌菌株RPD-1的生物學(xué)特性及其在菲律賓蛤仔育苗中的應(yīng)用. 海洋科學(xué), 34(7): 1—7

劉雙江, 孫 燕, 岑運(yùn)華等, 1995. 采用光合細(xì)菌控制水體中亞硝酸鹽的研究. 環(huán)境科學(xué), 16(6): 21—23

邱宏端, 石賢愛, 郭養(yǎng)浩等, 1999. 耐鹽和降高紅螺菌科細(xì)菌的選育及應(yīng)用. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), S1(23): 92—96

何 霞, 趙 彬, 呂 劍等, 2007. 異養(yǎng)硝化細(xì)菌Bacillussp.,LY脫氮性能研究. 環(huán)境科學(xué), 28(6): 1404—1408

陳 慧, 張德民, 王龍剛等, 2011. 一株反硝化光合細(xì)菌的生物學(xué)特性及系統(tǒng)發(fā)育分析. 微生物學(xué)報(bào), 51(2): 249—255

陳燕紅, 楊紫紅, 喻國輝等, 2010. 光照, 氧氣, pH和鹽度對(duì)沼澤紅假單胞菌2-8菌株生長和亞硝酸鹽消除的影響. 南方水產(chǎn), 6(4): 1—5

鄭 卉, 張德民, 王一農(nóng)等, 2012. 紅假單胞菌去除養(yǎng)魚廢水三態(tài)氮及COD的研究. 生態(tài)科學(xué), 31(4): 435—440

趙江艷, 傅英楠, 趙春貴等, 2011. 一株高含玫紅品的紅樹林海洋紫色硫細(xì)菌分離鑒定及特性. 微生物學(xué)報(bào), 51(10):1318—1325

侯 穎, 孫軍德, 徐建強(qiáng)等, 2006. 巨大芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖水體氨氮降解特性研究. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 37(4): 607—610

俞吉安, 張承康, 陳 峰, 2000. 光合細(xì)菌P4株的反硝化作用.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào), 34(11): 1579—1582

蔣 鵬, 趙春貴, 賈雅瓊等, 2014. 以亞硝氮為唯一氮源生長的海洋紫色硫細(xì)菌去除無機(jī)三態(tài)氮. 微生物學(xué)通報(bào), 41(5):824—831

APHA A, WPCF, 1998. Standard methods for the examination of water and wastewater. American Public Health Association,Washington DC.

Burford M A, Williams K C, 2001. The fate of nitrogenous waste from shrimp feeding. Aquaculture, 198(1): 79—93

Colt J E, Armstrong D, 1981. Nitrogen toxicity to crustaceans,fish, and molluscs. In: Allen L J, Kinney E C eds.Proceedings of Bio-engineering Symposium for Fish Culture.Fish Culture Section of the American Fisheries Society (FCS Publ.1) Bethesda, MD: 34—47

Corey P, Kim J K, Duston Jet al, 2013. Bioremediation potential ofPalmaria palmataandChondrus crispus(Basin Head):effect of nitrate and ammonium ratio as nitrogen source on nutrient removal. Journal of Applied Phycology, 25(5):1349—1358

Díaz V, Ibá?ez R, Gómez Pet al, 2012. Kinetics of nitrogen compounds in a commercial marine Recirculating Aquaculture System. Aquacultural Engineering, 50: 20—27

Foss A, Imsland A K, Roth Bet al, 2009. Effects of chronic and periodic exposure to ammonia on growth and blood physiology in juvenile turbot (Scophthalmus maximus).Aquaculture, 296(1—2): 45—50

Gutierrez-Wing M T, Malone R F, 2006. Biological filters in aquaculture: trends and research directions for freshwater and marine applications. Aquacultural Engineering, 34(3):163—171

Qi Z, Zhang X H, Boon Net al, 2009. Probiotics in aquaculture of China—Current state, problems and prospect. Aquaculture,290(1): 15—21

Trüper H G, Pfennig N, 1992. The family chlorobiaceae. In:Balows A, Trüper H G, Dworkin M eds. The Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology,Isolation, Identification, Applications. Springer-Verlag,Berlin, Germany: 3583—3592

Yusoff F M, Banerjee S, Khatoon Het al, 2011. Biological approaches in management of nitrogenous compounds in aquaculture systems. Dyhamic Biochemistry, Process Biotechnology and Molecular Biology, 5(Special Issue 1): 21—31

Zhou Q, Li K, Jun Xet al, 2009. Role and functions of beneficial microorganisms in sustainable aquaculture. Bioresources Technology, 100(16): 3780—3786