薛 飛 沈照立 沈 睿 陳先震

同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海200072

人腦膠質(zhì)瘤組織中微小RNA-21與磷酸酶和張力蛋白同源基因的表達(dá)及其臨床意義

薛 飛 沈照立 沈 睿 陳先震

同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海200072

目的初步探索microRNAR-21（miR-21）與磷酸酶和張力蛋白同源蛋白（PTEN）基因在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用RT-PCR檢測215例膠質(zhì)瘤（膠質(zhì)瘤組）和50例正常人腦組織（對照組）中miRNA-21的表達(dá)水平，采用SP免疫組化法檢測PTEN蛋白的表達(dá)情況，并探討二者在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果miR-21在膠質(zhì)瘤組中的相對表達(dá)量（2-ΔΔCT）（4.222±1.755）明顯高于對照組織（1.064±0.126），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PTEN在對照組中的表達(dá)率（100.00%）高于膠質(zhì)瘤組（49.30%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。膠質(zhì)瘤組中miR-21的表達(dá)量與PTEN在膠質(zhì)瘤組中的陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.448，P＜0.05）。結(jié)論miR-21在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)升高，可能通過負(fù)性調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，二者的表達(dá)可以顯示膠質(zhì)瘤的惡性程度，通過檢測二者在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)有助于評價(jià)膠質(zhì)瘤的惡性程度和生物學(xué)行為。

microRNAR-21；磷酸酶和張力蛋白同源蛋白；腦膠質(zhì)瘤；相關(guān)性

微小RNA（microRNA）是真核生物中一種長度約為20～22個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過特異性識別并結(jié)合靶mRNA的3'非編碼區(qū)（3'UTR）使靶mRNA降解，發(fā)揮其對基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在細(xì)胞的生長、分化、凋亡及代謝等活動中發(fā)揮著重要作用[1]。最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中同樣起到非常重要的作用[2]，并有大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，微小RNAR-21（miR-21）在結(jié)腸癌、乳腺癌和膀胱癌等腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)都表現(xiàn)出顯著異常[3-5]，在膠質(zhì)瘤表達(dá)的microRNA中，miR21表達(dá)水平升高最為明顯[6]。通過計(jì)算機(jī)預(yù)測軟件并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miR21的靶基因包括：張力蛋白同源（PTEN）、PDCD4、RECK、TIMP3、Fasl、TRIP、Tap6、HNRPK及Spry2，這些基因都發(fā)揮著抑制腫瘤生長的作用[7]。其中，磷酸酶和PTEN基因是具有磷酸酶活性的抑癌基因，其基因突變或缺失與多種惡性腫瘤密切相關(guān)[8]。miR21對PTEN的直接調(diào)控作用已經(jīng)在膠質(zhì)瘤、膀胱癌和胰腺癌中得到證實(shí)。目前尚沒有對miR21和PTEN二者在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)相關(guān)性報(bào)道，考慮到miR21和PTEN在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，研究二者在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及二者的相關(guān)性，為探討miR21和PTEN作為腫瘤標(biāo)志物的可能性提供重要依據(jù)，并為膠質(zhì)瘤的診斷、治療提供新的途徑和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2008～2012年同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）神經(jīng)外科膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織標(biāo)本215例為膠質(zhì)瘤組，其中男118例，女97例，男女比例1.21∶1；年齡6～70歲，平均（47.50±2.21）歲。選擇同期行腦外傷減壓術(shù)的腦組織50例為對照組，其中男女比例為1.19∶1；年齡8～69歲，平均（46.30±2.03）歲。病例組與對照組年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具有可比性。所有患者均為原發(fā)，有詳細(xì)的臨床資料和手術(shù)記錄，無其他嚴(yán)重并發(fā)癥，且所有患者均為第一次手術(shù)治療，術(shù)前均未行放、化療及免疫治療。所有患者或家屬知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)過我院倫理委員會通過。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Trizol購自美國Invitrogen公司；miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒及miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒購于北京天根生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；SP試劑盒、DAB試劑盒、蘇木精染液及鼠抗人PTEN單克隆抗體均購自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織總RNA提取用眼科剪將存于-80℃的組織剪碎，加入1 mL Trizol（將樣品完全覆蓋為宜），按照Trizol說明書提取組織中總RNA。應(yīng)用NANODROP 2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，選擇OD260/280為1.8～2.0的RNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 RT-PCR檢測膠質(zhì)瘤組織中miR-21的表達(dá)量取總RNA 0.5 μg，應(yīng)用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，37℃反應(yīng)60 min，-80℃?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增采用天根生物技術(shù)有限公司提供的miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒進(jìn)行，上游引物根據(jù)試劑盒提供的設(shè)計(jì)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，miR21的上游引物為：5'-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，內(nèi)參U6的上游引物序列為：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物由試劑盒提供。PCR擴(kuò)增條件為：94℃2 min，40個循環(huán)：94℃，20 s，60℃，35 s。每個反應(yīng)設(shè)三個復(fù)孔，記錄每個反應(yīng)的CT值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCT表示膠質(zhì)瘤組織中miR-21相對于正常人腦組織的表達(dá)倍數(shù)（相對表達(dá)量），其中△△CT=膠質(zhì)瘤組織（CTmiR-21-CTU6）-正常腦組織（CTmiR-21-CTU6）。

1.3.3 SP法檢測膠質(zhì)瘤組織中PTEN的表達(dá)采用SP法進(jìn)行PTEN檢測，操作流程按照試劑盒說明書進(jìn)行，用PBS作為陰性對照，已知PTEN陽性表達(dá)的膠質(zhì)瘤標(biāo)本作為陽性對照。PTEN陽性表達(dá)細(xì)胞均為細(xì)胞核或胞漿著色，呈棕黃色或黃褐色均勻顆粒狀。在高倍顯微鏡下，每張切片均選擇5個視野膠質(zhì)瘤細(xì)胞密集區(qū)域進(jìn)行觀察，每個視野內(nèi)計(jì)數(shù)100個膠質(zhì)瘤細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)≥50%為強(qiáng)陽性（+++），25%～＜50%為陽性（++），5%～＜25%為弱陽性（+），＜5%為陰性（-）。陽性率=（各組總例數(shù)-陰性細(xì)胞數(shù)）/各組總例數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman等級相關(guān)分析miR21與PTEN表達(dá)量的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-21在膠質(zhì)瘤組織和正常組織中的表達(dá)

膠質(zhì)瘤組中miR-21的相對表達(dá)量（2-ΔΔCT）（4.222±1.755）明顯高于正常腦組織的對照組（1.064± 0.126），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組miR-21的表達(dá)情況（x±s）

2.2 PTEN在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)

膠質(zhì)瘤組中PTEN的表達(dá)率為49.30%，正常腦組織的對照組中PTEN的表達(dá)率為100.00%，PTEN在膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組磷酸酶和張力蛋白同源基因的表達(dá)率情況

2.3 膠質(zhì)瘤組織中miR-21與PTEN表達(dá)的相關(guān)性

對215例膠質(zhì)瘤組中miR-21和PTEN的相對表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織中miR-21與PTEN的陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.448，P＜0.05）。見表3。

表3 miR-21與PTEN在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)相關(guān)性

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的46%，惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生率為（5～8）/10萬[9]。膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，沒有明顯界限，手術(shù)無法完全切除。放療、化療不能特異性殺死膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并且對神經(jīng)系統(tǒng)有嚴(yán)重的毒副作用。膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科領(lǐng)域的難題之一，至今沒有突破性進(jìn)展，且對其發(fā)生發(fā)展了解不夠透徹。因此，闡述其致病機(jī)制、尋找新的治療手段，對于攻克膠質(zhì)瘤非常重要。

miR-21在多種惡性腫瘤中表達(dá)均升高，這些腫瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝癌及宮頸癌，并通過調(diào)節(jié)抑癌基因或細(xì)胞分化、凋亡相關(guān)的基因而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已經(jīng)在膠質(zhì)瘤鑒定出表達(dá)量恒定改變的miRNA，其中最顯著的是miR-21。miR-21調(diào)控腫瘤生長機(jī)制的研究取得了一些進(jìn)展，其中，miR-21在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中通過調(diào)控程序性細(xì)胞死亡基因-4（PDCD4）抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[10]。通過篩選人結(jié)腸癌miRNA表達(dá)譜中過表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-21的過表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度高度相關(guān)[11]。PTEN是磷酸酶家族中發(fā)現(xiàn)的第一個有抑癌作用的基因，具有雙磷酸酶活性，在細(xì)胞的遷移、黏附及胚胎正常發(fā)育中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，并在抑制腫瘤生長中也發(fā)揮重要作用。

Huang等[12]運(yùn)用實(shí)時定量PCR和免疫組織化學(xué)染色，分析并對比了miR-21和PTEN蛋白在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達(dá)情況，研究結(jié)果表明miR-21在乳腺癌組織中表達(dá)水平高于對照組，而PTEN在正常乳腺組織中的表達(dá)水平高于乳腺組織中，并且miR-21與PTEN蛋白的表達(dá)在乳腺癌組織中呈負(fù)相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在肝細(xì)胞癌組織及細(xì)胞株中均呈高表達(dá)；體外培養(yǎng)肝細(xì)胞癌細(xì)胞，敲低miR-21的表達(dá)后檢測發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量增加，而肝癌細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)移及侵襲能力卻降低，可見PTEN作為miR-21的靶基因，其表達(dá)與miR-21呈負(fù)相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲中發(fā)揮重要最用[10]。以上研究表明，在肝癌和乳腺癌中PTEN是miR-21的靶基因，然而Hatley等[13]卻認(rèn)為在非小細(xì)胞肺癌中PTEN并不是miR-21的靶標(biāo)，可見人們對于腫瘤中miR-21與PTEN的關(guān)系仍未達(dá)成共識。

本研究通過RT-PCR技術(shù)檢測215例膠質(zhì)瘤患者中miR-21的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-21在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常腦組織。膠質(zhì)瘤組織中miR-21的相對表達(dá)量為（4.222±1.755），正常腦組織中miR-21的相對表達(dá)量為（1.064±0.126），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對215例膠質(zhì)瘤組織中miR-21和PTEN的表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤組織中miR-21與PTEN的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.448，P＜0.05）。miR-21在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)升高，可能通過負(fù)性調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。二者的表達(dá)可以顯示膠質(zhì)瘤的惡性程度，通過檢測二者在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)有助于評價(jià)膠質(zhì)瘤的惡性程度和生物學(xué)行為。

綜上所述，本研究為PTEN作為miR-21的靶基因提供了新的依據(jù)，miR-21和PTEN的表達(dá)水平可以膠質(zhì)瘤的惡性程度，通過檢測二者在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)有助于評價(jià)膠質(zhì)瘤的惡性程度和生物學(xué)行為。

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Expression of micro RNA-21 and phosphatase and tensin homology gene in glioma and their clinical significances

XUE FeiSHEN ZhaoliSHEN RuiCHEN Xianzhen
Department of Neurosurgery,the 10th People's Hospital Afflilated to Tongji University,Shanghai200072,China

ObjectiveTo investigate the expression of microRNAR-21(miR-21)and phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten(PTEN)in glioma and their clinical significances.MethodsThe expression of miR-21 was detected by RT-PCR in 215 glioma(glioma group)and 50 cases of normal brain tissues(control group).S-P immunohistochemical was used to detect the expression of PTEN.ResultsThe expression of miR-21(2-ΔΔCT)in the glioma group was(4.222±1.755),which was significantly higher than that in the control group(1.064±0.126),the difference was statistically significant(P＜0.05).The positive rate of PTEN protein in glioma group(49.30%)was lower than that in control group(100.00%),the difference was statistically significant(P＜0.05).There was negative correlation between miR-21 and the positive ratio of PTEN(r=-0.448,P＜0.05).ConclusionmiR-21 might play an important role in the down-regulation of PTEN and development of glioma,the expression of two show the malignant degree of glioma, it is helpfal to evaluate the malignant degree and biologic behavior of glioma by detecting both expression.

miR-21;PTEN;Glioma;Correlation

R739.41

A

1673-7210（2014）04（c）-0036-04

2013-11-30本文編輯：任念）

上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計(jì)劃項(xiàng)目（編號12 ZR1423400）。

陳先震（1976-），男，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師；研究方向：顯微神經(jīng)外科微創(chuàng)治療各種顱內(nèi)腫瘤、腦血管病、脊髓腫瘤。