蘇麗華+王璇琳++賀敏+李偉靜+任素萍+王春燕+喬志新+丁雪潔+何躍忠+于群++

[摘要] 目的 研究黑青稞籽皮提取物對心肌細胞缺氧/復氧（H/R）損傷的保護作用及其機制。 方法 取大鼠胚胎心肌細胞（H9c2），隨機分為5組：正常對照組（C組）、缺氧/復氧組（H/R組）、缺氧/復氧+低、中、高劑量藥物組（H/R+L、M、H組）。流式細胞術檢測細胞凋亡、細胞線粒體跨膜電位（ΔΨm）和細胞內活性氧（ROS）產(chǎn)生情況；Western blot方法檢測B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2），Bcl-2相關X蛋白（Bax），總絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（tAkt）和磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（pAkt）蛋白表達變化。 結果 藥物組[（H/R+L）組至（H/R+H組）]細胞凋亡比例為（26.7±2.9）%至（6.1±1.1）%，較H/R組[（57.3±10.4）%]明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）；與H/R組比較，藥物組ΔΨm升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01），ROS水平下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01），Bcl-2及pAkt表達升高，Bax及tAkt表達無明顯變化。 結論 黑青稞籽皮提取物對心肌細胞缺氧/復氧損傷具有保護作用，可抑制心肌細胞凋亡，其可能與Bcl-2/Bax調控和激活磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信號通路有關。

[關鍵詞] 黑青稞；籽皮提取物；心肌細胞；缺氧/復氧；凋亡

[中圖分類號] R284[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-7210（2014）04（c）-0021-04

Protective effect of black barley pericarp extract on cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury

SU Lihua1,2,3 WANG Xuanlin2 HE Min2 LI Weijing2 REN Suping2 WANG Chunyan3 QIAO Zhixin2 DING Xuejie2 HE Yuezhong3▲ YU Qun2▲

1.Department of Emergency, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Hu′nan Province, Changsha 410011, China; 2.Institute of Field Blood Transfusion, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China;3.Department of Emergency, the Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of black barley pericarp extract on cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury and to elucidate its underlying mechanism. Methods Cultured rat cardiac myoblast cells H9c2 were randomly divided into 5 groups: normal control group (C group), hypoxia/reoxygenation injury group (H/R group), and H/R followed by drug treatment with low/median/high dose group (HR+L, +M, +H group). Cell apoptosis, mitochondrial transmembrane potential (ΔΨm) and the generation of intracellular ROS were monitored by flow cytometer. The protein levels of Bcl-2, Bax, tAkt and pAkt in H9c2 cells were observed by Western blot assay. Results It was shown that black barley pericarp extract could reduce the apoptosis rate compared with H/R group cells [H/R group: (57.3±10.4)%, drug treat group (H/R+L) group→(H/R+H) group: (26.7±2.9)% to (6.1±1.1)%, P < 0.05], rescue the loss of mitochondrial transmembrane potential (P ＜ 0.01), and inhibit the production of ROS (P ＜ 0.01). Drug treatments increased the expression levels of Bcl-2 and pAkt rather than H/R group cells, accompanied with no changes in the expression levels of Bax and tAkt. Conclusion Black barley pericarp extract can protect cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury and suppress the apoptosis of cardiomyocytes, which may relate to Bcl-2/Bax regulation and PI3K-Akt activation pathway.

[Key words] Black barley; Pericarp extract; Cardiomyocytes; Hypoxia/reoxygenation; Apoptosis

心肌缺血再灌注損傷是冠心病、失血性休克及心血管手術中常見的病理損傷，可造成大量心肌細胞凋亡。心肌細胞的缺氧/復氧損傷與缺血再灌注損傷具有極為相似的病理生理機制。心肌的缺血再灌注損傷是一個極其復雜的病理生理過程，目前公認的主要致病機制包括氧化應激損傷、細胞內鈣超載、細胞凋亡、細胞能量喪失，中性粒細胞炎性反應激活等。伴隨著缺氧/復氧損傷過程產(chǎn)生的大量的自由基[1]，具有很強的化學活性，活躍的電子很容易與細胞的組成物質發(fā)生反應，使細胞膜脂質過氧化增強，抑制蛋白質的功能并且破壞核酸及染色體，從而破壞細胞的結構和功能。有效清除自由基，是阻止缺氧/復氧損傷進程的有效途徑。花色苷類物質在體外對1，1-二苯基-2苦肼自由基（DPPH·）、超氧陰離子（O2-·）、羥基自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）均具有清除作用，尤其對·OH的清除能力強于抗壞血酸，且清除作用與濃度呈量效關系[2]。

黑青稞是一種生長在高原低溫低氧環(huán)境中的農(nóng)作物，其表皮中含有豐富花色苷，黃酮及類黃酮等物質，藥理學研究表明，花色苷具有抗氧化、抗炎、降血脂、抑制腫瘤生成等生物學活性[3-4]，筆者在前期動物實驗中發(fā)現(xiàn)：黑青稞籽皮提取物能夠有效延長常壓缺氧及斷頭小鼠的存活時間，說明黑青稞籽皮提取物具有耐缺氧功效；同時，通過細胞學實驗結果發(fā)現(xiàn)：黑青稞籽皮提取物對心肌細胞的缺氧/復氧損傷具有良好的保護作用；經(jīng)過對黑青稞籽皮提取、分離，檢測，發(fā)現(xiàn)黑青稞籽皮提取物含有主要的花色苷物質為氯化花翠素。為了探討黑青稞籽皮提取物抗缺氧作用的可能機制，筆者進行了相關實驗研究，以期擴展花色苷的應用領域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞H9c2細胞（購自上?；馍锟萍加邢薰荆?。

1.1.2 主要試劑黑青稞籽皮提取物（本實驗室提供）；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）（Gibco，批號：1237443）；胎牛血清（Hyclone，批號：NXC0582）；連二亞硫酸鈉（國藥集團，批號：20120413）；C膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）凋亡檢測試劑盒（凱基生物技術發(fā)展有限公司，批號：130411）；線粒體膜電位檢測試劑盒（編號：C2006）及活性氧檢測試劑盒（編號：S0033）（碧云天生物技術研究所）；二辛可酸（BCA）蛋白定量試劑盒（Pierce，批號：OC185139）；抗體：B細胞淋巴瘤白血病-2（Bcl-2）（編號：#2870S），Bcl-2相關X蛋白（Bax）（編號：#2772S），絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt，編號：#4691S），磷酸化絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（pAkt，編號：#4056S），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，編號：#2118S），均購于Cell Signaling Technology。

1.2 心肌細胞培養(yǎng)

H9c2細胞置于含有15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。細胞貼壁生長至鋪滿80%~85%后，用0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 心肌細胞H/R模型的構建與實驗分組

采用化學性缺氧法，使用耗氧劑連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）建立缺氧模型。將Na2S2O4溶于低糖DMEM中，現(xiàn)用現(xiàn)配成終濃度為5 mmol/L Na2S2O4缺氧液。將含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液吸出，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后換上缺氧液，置于5%CO2培養(yǎng)箱內20 min，造成細胞缺氧；將缺氧液換成含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液放置于5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)8 h，使細胞復氧。

分別取正常培養(yǎng)的H9c2細胞隨機分為5組：正常對照組（C組）；缺氧/復氧組（H/R組）：按照上述缺氧/復氧模型培養(yǎng)；缺氧/復氧+低、中、高劑量藥物組（H/R+L、M、H組）：在復氧同時，在復氧培養(yǎng)基中加入已配制好的黑青稞籽皮提取物使其終濃度為75、150、 300 mg/L，余處理同H/R組。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

H9c2細胞按以上分組進行處理后，消化收集所有細胞，用預冷的PBS洗滌2次。加入C膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）凋亡檢測試劑盒中200 μL Binding Buffer重懸細胞，后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶（PI）輕輕混勻，避光室溫反應30 min，最后加入300 μL Binding Buffer混勻（Annexin V-FITC 和PI終濃度均為1 mg/L），立即上機檢測，計算各組細胞凋亡率。

1.5 線粒體跨膜電位（ΔΨm）檢測

H9c2細胞按以上分組進行處理后，消化收集所有細胞，PBS洗滌1次。用500 μL培養(yǎng)基重懸細胞后，加入500 μL四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物（JC-1）染色工作液（終濃度為12.5 mg/L），置于37℃孵育30 min，用預冷的染色緩沖液洗滌2次，立即上機檢測，計算各組細胞紅綠熒光值比例。

1.6 細胞內活性氧（ROS）檢測

H9c2按以上分組進行處理（但復氧及給藥時間縮短為4 h）后，消化收集所有細胞，PBS洗滌1次。加入用低糖DMEM稀釋的2′，7′-二氯氫化熒光素二酯（DCFH-DA）800 μL（終濃度為10 μmol/L），置于37℃孵育20 min。PBS洗滌細胞2次，立即上機，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm檢測各組細胞熒光強度。

1.7 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達改變

H9c2細胞按以上分組進行處理（但復氧及給藥時間縮短為4 h）后，消化收集所有細胞，PBS洗滌2次。向各組加入Western細胞裂解液重懸細胞，低溫放置30 min后，離心取上清，進行蛋白定量后，加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min變性處理。各組蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），后轉印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。將孵育過一抗和二抗的PVDF膜在Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)中進行檢測，以GAPDH作為內參蛋白。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黑青稞籽皮提取物處理對H9c2細胞凋亡的影響

結果顯示，C組細胞與H/R組的凋亡細胞所占百分比分別為（5.0±1.1）%和（57.3±10.4）%，藥物組中凋亡細胞百分率與H/R組相比呈濃度依賴性降低，從（26.7±2.9）%降低到（6.1±1.1）%[（H/R+L）組至（H/R+H）組]，給藥組和H/R組凋亡細胞百分率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05），且不同劑量藥物組間比較，差異有統(tǒng)計學差異（P ＜ 0.05）。說明黑青稞籽皮提取物具有抑制缺氧/復氧損傷細胞凋亡的作用，且具有一定的劑量依賴性（圖1，封三）。

2.2 黑青稞籽皮提取物對H9c2細胞線粒體跨膜電位的影響

用熒光探針JC-1對線粒體跨膜電位進行檢測，紅綠熒光的比例越高，線粒體跨膜電位越高。缺氧/復氧損傷細胞紅綠熒光比值為（6.0±0.5），線粒體跨膜電位較C組明顯下降。H/R+L、M、H組的黑青稞籽皮提取物處理后紅綠熒光比值分別為（8.8±0.7）、（8.6±0.4）和（10.3±0.4），均較H/R組升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01），說明黑青稞籽皮提取物處理后線粒體跨膜電位升高（圖2，封三）。

2.3 黑青稞籽皮提取物對H9c2細胞內ROS產(chǎn)生的影響

DCFH可被細胞內的活性氧氧化后生成有熒光的2′，7′-二氫二氯熒光黃（DCF），故DCF熒光值強度可反映ROS水平。H/R組DCF熒光強度為（87.7±1.3），較C組（12.0±3.1）明顯升高，說明缺氧/復氧損傷心肌細胞內產(chǎn)生大量活性氧。H/R+L、M、H劑量組的黑青稞籽皮提取物處理后DCF熒光強度分別為（46.5±1.6）、（40.5±5.3）和（32.4±3.3），較H/R組明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01），說明黑青稞籽皮提取物處理可降低缺氧/復氧細胞內的活性氧水平（圖3，封三）。

2.4 黑青稞籽皮提取物對Bcl-2，Bax蛋白表達的影響

和C組比較，缺氧/復氧損傷的細胞Bcl-2表達出現(xiàn)明顯下降，各劑量給藥組細胞Bcl-2表達低于C組，但明顯高于H/R組，其中150 mg/L劑量組Bcl-2表達最高，300 mg/L劑量組次之。而Bax蛋白在各組中均沒有出現(xiàn)明顯的變化（圖4）。

Bcl-2：B細胞淋巴瘤/白血病-2基因；Bax：Bcl-2相關X蛋白； CAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖4 各組細胞Bcl-2家族蛋白表達的水平

2.5 黑青稞籽皮提取物對Akt表達的影響

磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信號通路具有調控細胞代謝、增殖和凋亡的作用，尤其與細胞凋亡的線粒體調控關系密切。Western blotting結果顯示，各組中總絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（tAkt）蛋白的表達無顯著變化；而H/R組pAkt蛋白表達顯著降低，黑青稞籽皮提取物處理后，各劑量組pAkt表達仍低于C組，但較H/R顯著升高（圖5）。說明缺氧/復氧對tAkt表達無明顯影響，但對pAkt具有抑制作用，黑青稞籽皮提取物可能具有重新激活該通路的作用。

tAkt：總絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶；pAkt：磷酸絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；CAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖5 各組細胞Akt及Pakt蛋白表達的水平

3 討論

心肌細胞的缺氧/復氧損傷與缺血再灌注損傷具有極為相似的病理生理機制。缺血再灌注損傷的發(fā)生機制涉及到線粒體跨膜電位下降、氧自由基生成、細胞凋亡等。線粒體跨膜電位下降和膜通透性改變導致線粒體內物質轉移至胞漿中，引發(fā)系列凋亡過程，線粒體解聯(lián)的呼吸鏈會產(chǎn)生大量活性氧，而大量的活性氧可以氧化線粒體內膜上的心磷脂，加重線粒體解聯(lián)，二者相互作用，促進細胞凋亡[5]。ROS是心肌缺血再灌注損傷的主要啟動子之一，當?shù)蛲鰡雍螅琑OS進一步升高可加速凋亡過程。PI3K/Akt存活通路在心肌缺血再灌注損傷中起著重要的保護作用[6-7]。絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶C末端的Ser473殘基被磷酸化激活后，可作用于多種底物，包括Bcl-2家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，抑制細胞凋亡。在本實驗中，黑青稞籽皮提取物通過保護線粒體跨膜電位，抑制了活性氧產(chǎn)生，從而減少了活性氧對心肌細胞的損傷作用，這可能與激活PI3K/Akt通路及改變Bcl-2家族蛋白的表達水平密切相關。

通過高效液相色譜檢測，黑青稞籽皮提取物中總花色苷含量占籽皮提取物的7.6%，同時主要存在的天然花色苷物質為氯化花翠素（含量為5.7%）。目前關于花色苷對心肌細胞缺氧/復氧保護作用的研究熱點是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[8-9]，而對氯化花翠素相關研究較少[10]。通過本實驗筆者認識到，黑青稞籽皮提取物具有良好的心肌細胞保護作用，氯化花翠素是否單獨或者協(xié)同其他花色苷及類黃酮物質對心肌細胞缺氧/復氧損傷起到保護作用，即明確黑青稞籽皮提取物的功效物質基礎是下一步需要解決的問題。另外，黑青稞在耐缺氧/復氧損傷方面與紅景天具備一定的相似功效[11-12]。紅景天這一珍貴、稀缺的藏藥資源是非常有限的，而黑青稞在西藏地區(qū)廣為種植，在產(chǎn)量上比紅景天有明顯優(yōu)勢，因此未來有望以天然、綠色、低成本食品來源的天然植物替代珍貴的藥用資源，系本研究的意義所在。

[參考文獻]

[1]Skemiene K， Jablonskiene G， Liobikas J， et al. Protecting the heart against ischemia/reperfusion-induced necrosis and apoptosis： the effect of anthocyanins[J]. Medicina （Kaunas），2013，49（2）：84-88.

[2]張澤生，李博軒，王冀.葡萄皮中花色苷的體外抗氧化研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，（2）：148-151.

[3]Hiemori M， Koh E， Mitchell AE. Influence of cooking on anthocyanins in black rice （Oryza sativa L. japonica var. SBR）[J]. J Agric Food Chem，2009，57（5）：1908-1914.

[4]Zhao JG， Yan QQ， Lu LZ， et al. In vivo antioxidant， hypoglycemic， and anti-tumor activities of anthocyanin extracts from purple sweet potato[J]. Nutr Res Pract，2013，7（5）：359-365.

[5]Perrelli MG， Pagliaro P， Penna C. Ischemia/reperfusion injury and cardioprotective mechanisms： role of mitochondria and reactive oxygen species[J]. World J Cardiol，2011，3（6）：186-200.

[6]Perrelli MG， Tullio F， Angotti C， et al. Catestatin reduces myocardial ischaemia/reperfusion injury： involvement of PI3K/Akt， PKCs， mitochondrial KATP channels and ROS signalling [J]. Pflugers Arch，2013，465（7）：1031-1040.

[7]Wu QL， Shen T， Ma H， et al. Sufentanil postconditioning protects the myocardium from ischemia-reperfusion via PI3K/Akt-GSK-3beta pathway[J]. J Surg Res，2012， 178（2）：563-570.

[8]Paixao J， Dinis TC， Almeida LM. Protective role of malvidin-3-glucoside on peroxynitrite-induced damage in endothelial cells by counteracting reactive species formation and apoptotic mitochondrial pathway [J]. Oxid Med Cell Longev，2012，（2012）：428-538.

[9]Lopera YE， Fantinelli J， Gonzalez AL， et al. Antioxidant activity and cardioprotective effect of a nonalcoholic extract of vaccinium meridionale swartz during ischemia-reperfusion in rats[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2013，（2013）：516-727.

[10]Gopalan A， Reuben SC， Ahmed S， et al. The health benefits of blackcurrants [J]. Food Funct，2012，3（8）：795-809.

[11]Sun L， Isaak CK， Zhou Y， et al. Salidroside and tyrosol from Rhodiola protect H9c2 cells from ischemia/reperfusion-induced apoptosis[J]. Life Sci，2012，91（5-6）：151-158.

[12]譚洪玲，馬增春，高月.紅景天苷對心肌細胞缺氧/復氧的保護作用[J].解放軍藥學學報，2010，（3）：194-198.

（收稿日期：2013-10-30本文編輯：衛(wèi)軻）

[作者簡介] 蘇麗華（1988-），女，中南大學湘雅二醫(yī)院2011級在讀碩士研究生；研究方向：中毒急救。

▲共同通訊作者

2.4 黑青稞籽皮提取物對Bcl-2，Bax蛋白表達的影響

和C組比較，缺氧/復氧損傷的細胞Bcl-2表達出現(xiàn)明顯下降，各劑量給藥組細胞Bcl-2表達低于C組，但明顯高于H/R組，其中150 mg/L劑量組Bcl-2表達最高，300 mg/L劑量組次之。而Bax蛋白在各組中均沒有出現(xiàn)明顯的變化（圖4）。

Bcl-2：B細胞淋巴瘤/白血病-2基因；Bax：Bcl-2相關X蛋白； CAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖4 各組細胞Bcl-2家族蛋白表達的水平

2.5 黑青稞籽皮提取物對Akt表達的影響

磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信號通路具有調控細胞代謝、增殖和凋亡的作用，尤其與細胞凋亡的線粒體調控關系密切。Western blotting結果顯示，各組中總絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（tAkt）蛋白的表達無顯著變化；而H/R組pAkt蛋白表達顯著降低，黑青稞籽皮提取物處理后，各劑量組pAkt表達仍低于C組，但較H/R顯著升高（圖5）。說明缺氧/復氧對tAkt表達無明顯影響，但對pAkt具有抑制作用，黑青稞籽皮提取物可能具有重新激活該通路的作用。

tAkt：總絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶；pAkt：磷酸絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；CAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖5 各組細胞Akt及Pakt蛋白表達的水平

3 討論

心肌細胞的缺氧/復氧損傷與缺血再灌注損傷具有極為相似的病理生理機制。缺血再灌注損傷的發(fā)生機制涉及到線粒體跨膜電位下降、氧自由基生成、細胞凋亡等。線粒體跨膜電位下降和膜通透性改變導致線粒體內物質轉移至胞漿中，引發(fā)系列凋亡過程，線粒體解聯(lián)的呼吸鏈會產(chǎn)生大量活性氧，而大量的活性氧可以氧化線粒體內膜上的心磷脂，加重線粒體解聯(lián)，二者相互作用，促進細胞凋亡[5]。ROS是心肌缺血再灌注損傷的主要啟動子之一，當?shù)蛲鰡雍螅琑OS進一步升高可加速凋亡過程。PI3K/Akt存活通路在心肌缺血再灌注損傷中起著重要的保護作用[6-7]。絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶C末端的Ser473殘基被磷酸化激活后，可作用于多種底物，包括Bcl-2家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，抑制細胞凋亡。在本實驗中，黑青稞籽皮提取物通過保護線粒體跨膜電位，抑制了活性氧產(chǎn)生，從而減少了活性氧對心肌細胞的損傷作用，這可能與激活PI3K/Akt通路及改變Bcl-2家族蛋白的表達水平密切相關。

通過高效液相色譜檢測，黑青稞籽皮提取物中總花色苷含量占籽皮提取物的7.6%，同時主要存在的天然花色苷物質為氯化花翠素（含量為5.7%）。目前關于花色苷對心肌細胞缺氧/復氧保護作用的研究熱點是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[8-9]，而對氯化花翠素相關研究較少[10]。通過本實驗筆者認識到，黑青稞籽皮提取物具有良好的心肌細胞保護作用，氯化花翠素是否單獨或者協(xié)同其他花色苷及類黃酮物質對心肌細胞缺氧/復氧損傷起到保護作用，即明確黑青稞籽皮提取物的功效物質基礎是下一步需要解決的問題。另外，黑青稞在耐缺氧/復氧損傷方面與紅景天具備一定的相似功效[11-12]。紅景天這一珍貴、稀缺的藏藥資源是非常有限的，而黑青稞在西藏地區(qū)廣為種植，在產(chǎn)量上比紅景天有明顯優(yōu)勢，因此未來有望以天然、綠色、低成本食品來源的天然植物替代珍貴的藥用資源，系本研究的意義所在。

[參考文獻]

[1]Skemiene K， Jablonskiene G， Liobikas J， et al. Protecting the heart against ischemia/reperfusion-induced necrosis and apoptosis： the effect of anthocyanins[J]. Medicina （Kaunas），2013，49（2）：84-88.

[2]張澤生，李博軒，王冀.葡萄皮中花色苷的體外抗氧化研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，（2）：148-151.

[3]Hiemori M， Koh E， Mitchell AE. Influence of cooking on anthocyanins in black rice （Oryza sativa L. japonica var. SBR）[J]. J Agric Food Chem，2009，57（5）：1908-1914.

[4]Zhao JG， Yan QQ， Lu LZ， et al. In vivo antioxidant， hypoglycemic， and anti-tumor activities of anthocyanin extracts from purple sweet potato[J]. Nutr Res Pract，2013，7（5）：359-365.

[5]Perrelli MG， Pagliaro P， Penna C. Ischemia/reperfusion injury and cardioprotective mechanisms： role of mitochondria and reactive oxygen species[J]. World J Cardiol，2011，3（6）：186-200.

[6]Perrelli MG， Tullio F， Angotti C， et al. Catestatin reduces myocardial ischaemia/reperfusion injury： involvement of PI3K/Akt， PKCs， mitochondrial KATP channels and ROS signalling [J]. Pflugers Arch，2013，465（7）：1031-1040.

[7]Wu QL， Shen T， Ma H， et al. Sufentanil postconditioning protects the myocardium from ischemia-reperfusion via PI3K/Akt-GSK-3beta pathway[J]. J Surg Res，2012， 178（2）：563-570.

[8]Paixao J， Dinis TC， Almeida LM. Protective role of malvidin-3-glucoside on peroxynitrite-induced damage in endothelial cells by counteracting reactive species formation and apoptotic mitochondrial pathway [J]. Oxid Med Cell Longev，2012，（2012）：428-538.

[9]Lopera YE， Fantinelli J， Gonzalez AL， et al. Antioxidant activity and cardioprotective effect of a nonalcoholic extract of vaccinium meridionale swartz during ischemia-reperfusion in rats[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2013，（2013）：516-727.

[10]Gopalan A， Reuben SC， Ahmed S， et al. The health benefits of blackcurrants [J]. Food Funct，2012，3（8）：795-809.

[11]Sun L， Isaak CK， Zhou Y， et al. Salidroside and tyrosol from Rhodiola protect H9c2 cells from ischemia/reperfusion-induced apoptosis[J]. Life Sci，2012，91（5-6）：151-158.

[12]譚洪玲，馬增春，高月.紅景天苷對心肌細胞缺氧/復氧的保護作用[J].解放軍藥學學報，2010，（3）：194-198.

（收稿日期：2013-10-30本文編輯：衛(wèi)軻）

[作者簡介] 蘇麗華（1988-），女，中南大學湘雅二醫(yī)院2011級在讀碩士研究生；研究方向：中毒急救。

▲共同通訊作者

2.4 黑青稞籽皮提取物對Bcl-2，Bax蛋白表達的影響

和C組比較，缺氧/復氧損傷的細胞Bcl-2表達出現(xiàn)明顯下降，各劑量給藥組細胞Bcl-2表達低于C組，但明顯高于H/R組，其中150 mg/L劑量組Bcl-2表達最高，300 mg/L劑量組次之。而Bax蛋白在各組中均沒有出現(xiàn)明顯的變化（圖4）。

Bcl-2：B細胞淋巴瘤/白血病-2基因；Bax：Bcl-2相關X蛋白； CAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖4 各組細胞Bcl-2家族蛋白表達的水平

2.5 黑青稞籽皮提取物對Akt表達的影響

磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信號通路具有調控細胞代謝、增殖和凋亡的作用，尤其與細胞凋亡的線粒體調控關系密切。Western blotting結果顯示，各組中總絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（tAkt）蛋白的表達無顯著變化；而H/R組pAkt蛋白表達顯著降低，黑青稞籽皮提取物處理后，各劑量組pAkt表達仍低于C組，但較H/R顯著升高（圖5）。說明缺氧/復氧對tAkt表達無明顯影響，但對pAkt具有抑制作用，黑青稞籽皮提取物可能具有重新激活該通路的作用。

tAkt：總絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶；pAkt：磷酸絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；CAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖5 各組細胞Akt及Pakt蛋白表達的水平

3 討論

心肌細胞的缺氧/復氧損傷與缺血再灌注損傷具有極為相似的病理生理機制。缺血再灌注損傷的發(fā)生機制涉及到線粒體跨膜電位下降、氧自由基生成、細胞凋亡等。線粒體跨膜電位下降和膜通透性改變導致線粒體內物質轉移至胞漿中，引發(fā)系列凋亡過程，線粒體解聯(lián)的呼吸鏈會產(chǎn)生大量活性氧，而大量的活性氧可以氧化線粒體內膜上的心磷脂，加重線粒體解聯(lián)，二者相互作用，促進細胞凋亡[5]。ROS是心肌缺血再灌注損傷的主要啟動子之一，當?shù)蛲鰡雍?，ROS進一步升高可加速凋亡過程。PI3K/Akt存活通路在心肌缺血再灌注損傷中起著重要的保護作用[6-7]。絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶C末端的Ser473殘基被磷酸化激活后，可作用于多種底物，包括Bcl-2家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，抑制細胞凋亡。在本實驗中，黑青稞籽皮提取物通過保護線粒體跨膜電位，抑制了活性氧產(chǎn)生，從而減少了活性氧對心肌細胞的損傷作用，這可能與激活PI3K/Akt通路及改變Bcl-2家族蛋白的表達水平密切相關。

通過高效液相色譜檢測，黑青稞籽皮提取物中總花色苷含量占籽皮提取物的7.6%，同時主要存在的天然花色苷物質為氯化花翠素（含量為5.7%）。目前關于花色苷對心肌細胞缺氧/復氧保護作用的研究熱點是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[8-9]，而對氯化花翠素相關研究較少[10]。通過本實驗筆者認識到，黑青稞籽皮提取物具有良好的心肌細胞保護作用，氯化花翠素是否單獨或者協(xié)同其他花色苷及類黃酮物質對心肌細胞缺氧/復氧損傷起到保護作用，即明確黑青稞籽皮提取物的功效物質基礎是下一步需要解決的問題。另外，黑青稞在耐缺氧/復氧損傷方面與紅景天具備一定的相似功效[11-12]。紅景天這一珍貴、稀缺的藏藥資源是非常有限的，而黑青稞在西藏地區(qū)廣為種植，在產(chǎn)量上比紅景天有明顯優(yōu)勢，因此未來有望以天然、綠色、低成本食品來源的天然植物替代珍貴的藥用資源，系本研究的意義所在。

[參考文獻]

[1]Skemiene K， Jablonskiene G， Liobikas J， et al. Protecting the heart against ischemia/reperfusion-induced necrosis and apoptosis： the effect of anthocyanins[J]. Medicina （Kaunas），2013，49（2）：84-88.

[2]張澤生，李博軒，王冀.葡萄皮中花色苷的體外抗氧化研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，（2）：148-151.

[3]Hiemori M， Koh E， Mitchell AE. Influence of cooking on anthocyanins in black rice （Oryza sativa L. japonica var. SBR）[J]. J Agric Food Chem，2009，57（5）：1908-1914.

[4]Zhao JG， Yan QQ， Lu LZ， et al. In vivo antioxidant， hypoglycemic， and anti-tumor activities of anthocyanin extracts from purple sweet potato[J]. Nutr Res Pract，2013，7（5）：359-365.

[5]Perrelli MG， Pagliaro P， Penna C. Ischemia/reperfusion injury and cardioprotective mechanisms： role of mitochondria and reactive oxygen species[J]. World J Cardiol，2011，3（6）：186-200.

[6]Perrelli MG， Tullio F， Angotti C， et al. Catestatin reduces myocardial ischaemia/reperfusion injury： involvement of PI3K/Akt， PKCs， mitochondrial KATP channels and ROS signalling [J]. Pflugers Arch，2013，465（7）：1031-1040.

[7]Wu QL， Shen T， Ma H， et al. Sufentanil postconditioning protects the myocardium from ischemia-reperfusion via PI3K/Akt-GSK-3beta pathway[J]. J Surg Res，2012， 178（2）：563-570.

[8]Paixao J， Dinis TC， Almeida LM. Protective role of malvidin-3-glucoside on peroxynitrite-induced damage in endothelial cells by counteracting reactive species formation and apoptotic mitochondrial pathway [J]. Oxid Med Cell Longev，2012，（2012）：428-538.

[9]Lopera YE， Fantinelli J， Gonzalez AL， et al. Antioxidant activity and cardioprotective effect of a nonalcoholic extract of vaccinium meridionale swartz during ischemia-reperfusion in rats[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2013，（2013）：516-727.

[10]Gopalan A， Reuben SC， Ahmed S， et al. The health benefits of blackcurrants [J]. Food Funct，2012，3（8）：795-809.

[11]Sun L， Isaak CK， Zhou Y， et al. Salidroside and tyrosol from Rhodiola protect H9c2 cells from ischemia/reperfusion-induced apoptosis[J]. Life Sci，2012，91（5-6）：151-158.

[12]譚洪玲，馬增春，高月.紅景天苷對心肌細胞缺氧/復氧的保護作用[J].解放軍藥學學報，2010，（3）：194-198.

（收稿日期：2013-10-30本文編輯：衛(wèi)軻）

[作者簡介] 蘇麗華（1988-），女，中南大學湘雅二醫(yī)院2011級在讀碩士研究生；研究方向：中毒急救。

▲共同通訊作者