姜峰 王志龍 王巧云 申玉星

(1.華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州510640;2.廣州計(jì)量檢測(cè)技術(shù)研究院，廣東廣州510030)

Dodds［1］于1938年首次合成了雙烯雌酚(Dienestrol，DIEN)，隨后人們又對(duì)其合成制備［2］、電子密度［3］和生物代謝效應(yīng)［4］等進(jìn)行了詳細(xì)的研究.雙烯雌酚作為一種常見的人工合成非甾類雌激素，從20世紀(jì)60年代起作為重要的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，曾經(jīng)廣泛使用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)，以促進(jìn)動(dòng)物蛋白質(zhì)沉積和快速增重［5-7］.相對(duì)于天然雌激素，合成雌激素較為穩(wěn)定，易在動(dòng)物脂肪和組織內(nèi)殘留，進(jìn)而通過食物鏈危害人類健康［8］.

由于此類激素存在潛在致癌和致畸風(fēng)險(xiǎn)［9-11］，歐盟相關(guān)法規(guī)96/22/EC已禁止將其用于畜牧生產(chǎn)，并對(duì)其在動(dòng)物性食品中的殘留進(jìn)行監(jiān)控;我國(guó)也出臺(tái)了多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn) (GB/T 20766—2006，GB/T 20767—2006等)嚴(yán)格控制其在食品中的殘留.由于雙烯雌酚的檢測(cè)方法繁雜而多樣［12-13］，因此，雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的開發(fā)和使用對(duì)保證臨床檢驗(yàn)、食品安全、環(huán)境保護(hù)等相關(guān)檢測(cè)的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性具有重要意義.文中介紹了雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制過程，對(duì)雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的物化性質(zhì)進(jìn)行了分析，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度進(jìn)行了詳細(xì)評(píng)定.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要儀器與試劑

1200型高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器)、7890A型氣相色譜儀(配火焰離子化檢測(cè)器)，ZORBAX Eclipse XDB-C18 9.4 mm×250 mm×5 μm型半制備液相色譜柱，美國(guó) Agilent公司生產(chǎn);Bru ker/Agilent 1290-microTOF QII型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，德國(guó) Bruker公司/美國(guó) Agilent公司生產(chǎn); 400MHz核磁共振儀，德國(guó) Bruker公司生產(chǎn);Spectrum Two型紅外光譜儀，美國(guó)珀金埃爾默儀器(上海)有限公司生產(chǎn);831 KF型卡氏水分儀，瑞士萬(wàn)通公司生產(chǎn);AAF11/18型馬弗爐，英國(guó)Carbolite公司生產(chǎn);雙烯雌酚原料，上海紫一試劑廠生產(chǎn);乙腈，德國(guó)MERK公司生產(chǎn)，色譜純;其他試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水.

1.2 雙烯雌酚高純?cè)匣衔锏闹苽?/h3>

采用半制備高效液相色譜法通過多次制備得到雙烯雌酚高純?cè)匣衔?將雙烯雌酚原料(HPLC歸一化法純度約為94.00%)于乙腈中超聲溶解，配制成質(zhì)量濃度為35 g/L的樣品備用;再經(jīng)半制備型HPLC制備分離，收集保留時(shí)間10.0～12.0 min的餾分，離心旋蒸濃縮，冷凍干燥得到白色粉末;將制備得到的化合物作為雙烯雌酚高純?cè)匣衔?半制備色譜條件:ZORBAX Eclipse XDB-C18 9.4mm× 250mm×5 μm型半制備型色譜柱，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，流速4mL/min，流動(dòng)相為乙腈與水體積比為1∶1的混合液，進(jìn)樣量100 μL，分析時(shí)間16min，進(jìn)樣方式為Agilent標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣;收集方式為手動(dòng)收集.

1.3 雙烯雌酚高純?cè)匣衔锏亩ㄐ苑治?/h3>

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，核磁共振氫譜、碳譜法和紅外光譜法對(duì)制得的原料化合物進(jìn)行定性分析.

1.4 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中有機(jī)主成分含量的測(cè)定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范ISO Guide 34和ISO Guide 35的要求，選用高效液相色譜法并聯(lián)合多家實(shí)驗(yàn)室對(duì)雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的有機(jī)主成分含量進(jìn)行測(cè)定.通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，在保證分離的前提下，選擇雜質(zhì)與主體成分吸收都比較好的波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng).實(shí)驗(yàn)采用 Agilent 1200型液相色譜儀，ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6 mm×250 mm×5μm色譜柱，流動(dòng)相為乙腈與水體積比為70∶30的混合液，檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，檢測(cè)波長(zhǎng)為220、230、239、260nm，定值波長(zhǎng)為230nm.共有7家實(shí)驗(yàn)室參加，每家實(shí)驗(yàn)室7瓶樣品(每瓶樣品測(cè)量3次，所有純度結(jié)果均為HPLC歸一化結(jié)果)，每家實(shí)驗(yàn)室分別給出1-7瓶樣品的測(cè)量平均值.

1.5 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制相關(guān)技術(shù)規(guī)范，抽取15個(gè)包裝，做瓶間和瓶?jī)?nèi)均勻性檢驗(yàn)(每個(gè)包裝樣品測(cè)3次).實(shí)驗(yàn)采用Agilent 1200型液相色譜儀，ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6mm×250mm×5μm色譜柱流動(dòng)相為乙腈與水體積比為70∶30的混合液，檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm.

1.6 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗(yàn)

穩(wěn)定性檢驗(yàn)按先密后疏的原則，取6個(gè)包裝，每個(gè)包裝測(cè)量3次，取平均值，得到穩(wěn)定性檢驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)純度含量數(shù)據(jù).實(shí)驗(yàn)條件同1.5節(jié)。

1.7 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中水分、金屬元素、灰分及揮發(fā)性物質(zhì)含量的分析

采用卡氏水分儀(卡爾費(fèi)休容量法)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的水分含量，測(cè)量10次取平均值;采用ICPOES測(cè)定Al、As、Ba、Be、B、Cd、Ca、Ce、Cs、Cr、Co、Cu、Dy、Er、Eu、Gd、Ga、Ho、Fe、La、Pb、Lu、Mg、Mn、Nd、Ni、P、K、Pr、Rb、Sm、Se、Ag、Na、Sr、S、Tl、Th、Tm、U、V、Yb共42種無機(jī)金屬元素的含量;采用GCFID檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的揮發(fā)性物質(zhì);采用灼燒灰化質(zhì)量差法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的灰分含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 雙烯雌酚高純?cè)匣衔锏亩ㄐ苑治鼋Y(jié)果

雙烯雌酚高純?cè)匣衔锏馁|(zhì)譜圖如圖1所示.由圖1可見，目標(biāo)組分分子離子峰(M+H)+的質(zhì)荷比m/z為267.1284，非常接近于雙烯雌酚相對(duì)分子質(zhì)量(266.1307)加上氫原子量(1.0000)，由此可以確定雙烯雌酚高純?cè)匣衔锱c雙烯雌酚具有相同的分子質(zhì)量.

圖1 雙烯雌酚高純?cè)匣衔锏馁|(zhì)譜圖Fig.1 MS spectrum of high-purity raw material of dienestrol

雙烯雌酚高純?cè)匣衔锏?HNMR和13CNMR譜如圖2所示.通過對(duì)1HNMR譜圖的分析，發(fā)現(xiàn)有5組化學(xué)環(huán)境不同的特征氫，它們與雙烯雌酚的氫原子個(gè)數(shù)和空間耦合關(guān)系完全相符.通過對(duì)13CNMR譜圖的分析，7組碳原子的數(shù)量與化學(xué)位移同雙烯雌酚完全相符.

圖2 雙烯雌酚高純?cè)匣衔锏?HNMR和13CNMR譜圖Fig.2 1HNMR and13CNMR spectra of high-purity raw material of dienestrol

最后通過雙烯雌酚高純?cè)匣衔锖碗p烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的紅外光譜圖(見圖3(a)和3(b))的比較，再次確認(rèn)雙烯雌酚高純?cè)匣衔餅槟繕?biāo)化合雙烯雌酚，結(jié)構(gòu)式如圖4.

圖4 雙烯雌酚的分子結(jié)構(gòu)Fig.4 Molecular structure of dienestrol

2.2 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中有機(jī)主成分含量的測(cè)定結(jié)果

采用高效液相色譜法并聯(lián)合多家實(shí)驗(yàn)室對(duì)雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中有機(jī)主成分的含量進(jìn)行測(cè)定，并分別利用柯克倫檢驗(yàn)［9］和狄克遜檢驗(yàn)［9］對(duì)7家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表1所示.由表1所示結(jié)果可知實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無可疑值，由多家實(shí)驗(yàn)室合作測(cè)量確定的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的有機(jī)主成分的含量為99.52%.

表1 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有機(jī)主成分含量的多實(shí)驗(yàn)室合作測(cè)定結(jié)果Table 1 Multi-lab measurement results of organic principal components in certified reference material for purity determination of dienestrol

2.3 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最基本的屬性，是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值在空間分布一致程度的表征.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性通常用差方分析法來檢驗(yàn).具體檢驗(yàn)方法如下:

通過隨機(jī)抽取一定數(shù)量的樣品，采用相同的試驗(yàn)方法，在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下得m組等精度測(cè)量數(shù)據(jù)如下:

(m)xm1，xm2，…，xmnm，平均值;

表2 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Homogeneity testi results of certified reference material for purity determinootion of dienestrol

2.4 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)測(cè)得的純度含量數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度特性量值隨時(shí)間變化的圖，擬合回歸曲線，用該曲線斜率的顯著性來評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，該方法為趨勢(shì)分析法.分析方法如下:設(shè)時(shí)間對(duì)特性量值的直線方程為y=b0+b1x，斜率分別是時(shí)間與特性量值.截距;直線的標(biāo)準(zhǔn)偏差，斜率的標(biāo)準(zhǔn)偏差(即斜率的不確定度);當(dāng)置信度水平取95%時(shí)，－0＜t0.95，n－2·s(b1)，表明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性良好.穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示，從表中數(shù)據(jù)看，在1年時(shí)間內(nèi)，檢測(cè)數(shù)據(jù)組間和各時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)無顯著性差異，雙烯雌酚的純度值變化差異不大.經(jīng)趨勢(shì)分析，時(shí)間與特性量值的回歸趨勢(shì)線的斜率b1為 -0.000 279 0，t0.95，n-2·s(b1)為0.003 141，即︱b1︱＜t0.95，n-2·s(b1)，因此斜率估計(jì)值不顯著，表示雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度沒有發(fā)生顯著性變化.穩(wěn)定性引入的不確定度為ustable=0.012%.

表3 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Stability test results of certified reference material for purity determination of dienestrol

2.5 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中水分、金屬元素、灰分及揮發(fā)性物質(zhì)含量的分析結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中水分含量為0.03000%，灰分含量為0.001000%，Al、As、Ba、Be、B、Cd、Ca、Ce、Cs、Cr、Co、Cu、Dy、Er、Eu、Gd、Ga、Ho、Fe、La、Pb、Lu、Mg、Mn、Nd、Ni、P、K、Pr、Rb、Sm、Se、Ag、Na、Sr、S、Tl、Th、Tm、U、V、Yb等共42種無機(jī)金屬元素含量為0.00007900%，未檢出雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中含有無紫外吸收的揮發(fā)性物質(zhì).

3 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度評(píng)定

［15］中的方法對(duì)雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行不確定度評(píng)定.主要的不確定度來源于多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合測(cè)定雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)的有機(jī)主成分含量以及均勻性與穩(wěn)定性檢驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上最終合成了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度.

3.1 有機(jī)主成分含量測(cè)定引入的不確定度

多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合測(cè)定雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的有機(jī)主成分含量時(shí)所引入的不確定度由3部分組成:將合作實(shí)驗(yàn)室的平均值作為一組新的測(cè)量值，該組測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差作為不確定度來源之一，即u1=0.27%;多家合作測(cè)量所用的方法的重復(fù)性，取各家測(cè)量結(jié)果中最大的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，即u2= 0.045%;合作測(cè)量所用的方法(即液相色譜法)的響應(yīng)因子引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3.u3按下式進(jìn)行量化:

u3-i=Rimax，-Riset，，

其中，Rimax，表示各組分在不同波長(zhǎng)下的最大響應(yīng)值，Riset，表示目標(biāo)組分在設(shè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)下的響應(yīng)值，i表示檢測(cè)波長(zhǎng).

假設(shè)由各組分在不同波長(zhǎng)下的響應(yīng)差異引入的不確定度呈均勻分布，則u3可計(jì)算如下:

雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的檢測(cè)結(jié)果如表4所示.由表4所示結(jié)果計(jì)算可得u3=0.11%.

表4 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Test results at different wavelengths of purity certified reference material for purity determination of dienestrol

3.2 相對(duì)合成不確定度

由于雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的水分、灰分、無機(jī)元素、揮發(fā)性物質(zhì)含量均小于0.1%，其不確定度可忽略不計(jì).因此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的最終不確定度由3部分組成，即:標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中有機(jī)主成分含量測(cè)定所引入的不確定度(u1，u2，u3)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性引入的不確定度ueven和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度ustable.

雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)合成不確定度按下式計(jì)算:

將u1、u2、u3、ueven、ustable的取值代入式中計(jì)算得u=0.30%.

3.3 相對(duì)擴(kuò)展不確定度

雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)擴(kuò)展不確定度計(jì)算如下:

3.4 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果

雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的最終純度由質(zhì)量平衡法來確定.質(zhì)量平衡法要求首先確定樣品中各種雜質(zhì)的含量，包括非揮發(fā)性雜質(zhì)(有機(jī)雜質(zhì))、水分、揮發(fā)性溶劑和灼燒殘?jiān)?，再?gòu)目偽镔|(zhì)中減去上述雜質(zhì)得到該物質(zhì)的含量，可以直接溯源到國(guó)際單位制(SI)中質(zhì)量單位(kg)，是一種潛在的基準(zhǔn)方法［16］.

文中測(cè)定的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中有機(jī)主成分含量(Po)為99.52%，水分含量(Xw)為0.03000%，灰分含量(Xa)為0.001 000%，無機(jī)金屬元素含量(Xe)為0.00007900%，揮發(fā)性物質(zhì)(Xv)含量為0.根據(jù)質(zhì)量平衡法確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最終純度為

修約為99.4%.

故此，文中研制的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為99.4%，擴(kuò)展不確定度為0.6%(k=2).

4 結(jié)論

文中通過半制備高壓液相色譜法制備了雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、核磁共振氫譜、碳譜法和紅外光譜法對(duì)制得的原料化合物進(jìn)行了定性分析，采用多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值法對(duì)雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的有機(jī)主成分含量進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性、水分含量、灰分含量、揮發(fā)性物質(zhì)含量、無機(jī)金屬元素含量進(jìn)行了分析，并對(duì)雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度進(jìn)行了評(píng)定，得出以下主要結(jié)論:

(1)研制的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好

(2)1年內(nèi)，研制的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度變化不大，穩(wěn)定性較好;

(3)研制的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的水分、灰分、無機(jī)元素、揮發(fā)性物質(zhì)含量均小于0.1%;

(4)研制的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為99.4%，擴(kuò)展不確定度為0.6%(k=2).

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