劉玉新張麗艷滕學(xué)仁欒艦

金葡菌法制備Wistar大鼠脛骨骨髓炎骨缺損模型*

劉玉新①?gòu)堺惼G②滕學(xué)仁①欒艦①

目的：研究將蘸有金黃色葡萄球菌懸液的棉條植入Wistar大鼠脛骨骨缺損中制備骨髓炎骨缺損標(biāo)本的方法。方法：將健康雄性Wistar大鼠30只按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，每組10只20個(gè)后腿標(biāo)本。第1組：在Wistar大鼠雙側(cè)脛骨近端制造骨缺損；第2組：將蘸有金黃色葡萄球菌懸液的棉條置入骨缺損中；第3組：應(yīng)用抗生素治療將蘸有金黃色葡萄球菌懸液的棉條置入骨缺損中的大鼠。比較各組大鼠創(chuàng)口愈合時(shí)間，并在7、14 d時(shí)觀察大鼠體重、體溫、傷口愈合、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、脛骨標(biāo)本及CR并進(jìn)行比較。結(jié)果：三組在體重、體溫、傷口愈合情況、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、脛骨標(biāo)本及CR表現(xiàn)積分上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：在脛骨骨缺損中植入蘸有金黃色葡萄球菌懸液的棉條是制備Wistar大鼠脛骨骨髓炎骨缺損的良好方法。

大鼠； 骨髓炎； 骨缺損

骨髓炎（Osteomyelitic bone defect，OBD）是一個(gè)由于微生物感染導(dǎo)致骨骼破壞的炎癥反應(yīng)過(guò)程。其治療對(duì)于醫(yī)護(hù)工作人員來(lái)說(shuō)也是非常棘手的，尤其慢性骨髓炎骨缺損，纏綿難愈，反復(fù)發(fā)作[1-5]。臨床上對(duì)OBD治療的研究很多，關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型量也很多，也發(fā)表了很多骨髓炎標(biāo)本制備的文章，然而未發(fā)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的Wistar大鼠骨髓炎骨缺損模型的制備流程[6-10]?；诖?，筆者本文介紹了一種制造Wistar大鼠骨髓炎骨缺損模型的簡(jiǎn)單實(shí)用的新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及動(dòng)物 金黃色葡萄球菌懸液：標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC25923），濃度：3×106CFU；氯胺酮：0.1 g/2 mL；甲醛溶液：10%中性；Wistar健康雄性大鼠30只，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)6周齡，190～210 g，平均201 g。

1.2 方法 30只大鼠隨機(jī)分為三組，每組10只取雙側(cè)脛骨近端標(biāo)本共20個(gè)。將每只大鼠稱重，腹部皮下注射氯胺酮（150 mg/kg）麻醉，以8% Na2S脫毛，生理鹽水沖洗干凈后，將大鼠仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，碘伏消毒術(shù)區(qū)皮膚，鋪無(wú)菌洞巾，在膝關(guān)節(jié)下沿脛骨前脊內(nèi)側(cè)切開(kāi)長(zhǎng)約1.5 cm皮膚切口，在脛骨前肌內(nèi)側(cè)進(jìn)入達(dá)骨膜，顯露脛骨上端的前內(nèi)側(cè)面，在膝關(guān)節(jié)間隙下方1.5～2 mm向下以尖刀片切取骨前內(nèi)側(cè)面骨皮質(zhì)，將該骨皮質(zhì)片取出，造成成骨缺損。筆者所切取的皮質(zhì)骨片和脛骨近端內(nèi)側(cè)面形狀相關(guān)，皮質(zhì)骨片的縱徑為該骨片中點(diǎn)橫徑的2倍，長(zhǎng)度：7.0～8.5 mm，平均7.6 mm，骨片橫徑為該處脛骨前內(nèi)側(cè)面骨質(zhì)橫徑的0.8倍，長(zhǎng)度：3.5～4.3 mm，平均3.8 mm。取下皮質(zhì)骨片后，第1組：殘腔不做處理，分兩層縫合；第2、3組：將蘸有0.3 mL 3×106CFU的金葡菌棉條植入殘腔內(nèi)，并注射5%魚肝油酸鈉后，骨蠟封閉殘腔，創(chuàng)口分兩層縫合，不包扎。術(shù)后第7天時(shí)，觀察第1、2組的各項(xiàng)指標(biāo)。第3組，7 d后開(kāi)始肌注用頭孢呋辛100 mg/（kg·d），術(shù)后第14天時(shí)，觀察該組的各項(xiàng)指標(biāo)及第1組的體重指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo) （1）體重：術(shù)后第7、14天時(shí)觀察三組的體重情況；（2）肛溫：實(shí)驗(yàn)時(shí)，當(dāng)天上午9點(diǎn)麻醉后，測(cè)量肛溫；（3）白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）：斷尾法取血；（4）肉眼觀察脛骨標(biāo)本：按照Rissing[11]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分評(píng)定；（5）CR檢查：術(shù)后7 d，按照Smeltzer等[12]人制定的Smeltzer評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)定分，總分為20分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析法及t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用 χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異與統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組傷口愈合情況比較 傷口按照甲、乙、丙愈合標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且第1組甲級(jí)愈合與第2、3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組創(chuàng)口愈合情況比較 個(gè)

2.2 三組體重比較 麻醉后，大鼠采用電光分析天平稱重，7 d時(shí)，第1組的體重與第2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；14 d時(shí)，第1組的體重與第3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 三組體重比較（±s） g

表2 三組體重比較（±s） g

*與第2組比較，P＜0.05；△與第3組比較，P＜0.05

2.3 三組其他指標(biāo)的比較 三組的肛溫、WBC計(jì)數(shù)、Rissing評(píng)分、Smeltzer評(píng)分比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。肉眼觀察脛骨標(biāo)本情況：第1組無(wú)死骨及感染性炎癥反應(yīng)；第2組骨髓炎急性期（圖1、2）；第3組形成骨髓炎骨缺損模型（圖3、4）。

表3 三組其他指標(biāo)的比較（±s）

表3 三組其他指標(biāo)的比較（±s）

*與第2、3組比較，P＜0.05；△與第3組比較，P＜0.05

組別 體溫（℃） WBC（×109/L） Rissing評(píng)分（分） Smeltzer評(píng)分（分）第1組（n=10） 35.63±0.62* 8.58±2.35* 0* 0*第2組（n=10） 36.81±0.75 17.34±4.97△ 3.62±1.26 10.62±5.26 第3組（n=10） 36.54±0.63 12.54±4.10 2.81±0.96 8.81±1.66

圖1 骨髓炎急性期膿腔形成

圖2 骨髓炎急性期

3 討論

目前，骨髓炎生物學(xué)模型的制作有Stefan法、Fitzgeraid法和Norden法等[13-15]。Stefan法是在Wister大白鼠股靜脈內(nèi)注入金黃色葡萄球菌液制作動(dòng)物脛骨骨髓炎模型，但是，該實(shí)驗(yàn)操作困難，效果不確切，成功率低。Fitzgeraid法是以兔脛骨為標(biāo)本，用金黃色葡萄球菌加骨水泥填入骨缺損，該法由于填充了骨水泥，不利于進(jìn)一步的手術(shù)操作處理。Norden法和Fitzgeraid法類似，筆者在其基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，在Wistar大鼠脛骨上段制造的骨缺損腔內(nèi)植入蘸有0.3 mL 3×106CFU金黃色葡萄球菌液的紗布，并腔內(nèi)注射5%魚肝油酸鈉后，以骨蠟封閉骨缺損口，成功制造出模型。術(shù)后7 d時(shí)，脛骨標(biāo)本顯示：第1組無(wú)死骨及感染性炎癥反應(yīng)，BD清晰存在，殘腔內(nèi)填充肉芽組織，邊緣骨膜收縮，髓腔未閉；CR未見(jiàn)死骨形成。第2組創(chuàng)口未愈合，局部發(fā)紅、腫脹，可觸及波動(dòng)感，或者竇道形成，創(chuàng)口內(nèi)有黃色黏稠膿液流出，骨缺損局部有骨膜反應(yīng)，殘留死腔；CR表現(xiàn)為脛骨上段出現(xiàn)軟組織腫脹陰影，膿腔形成（圖1）；脛骨局部有矩形缺損區(qū)，邊緣有骨溶解破壞，骨小梁排列紊亂，周圍局限性骨質(zhì)疏松，邊緣骨密度增高。骨膜反應(yīng)、毛糙及不同程度增厚，為骨髓炎急性期（圖2）。第3組各種癥狀較急性期有所減輕，脛骨上段局部可見(jiàn)竇道、肉芽及瘢痕組織生成，有較稀薄膿液性滲出，殘腔周圍髓腔封閉；CR見(jiàn)脛骨上端軟組織腫脹陰影減小，骨矩形缺損區(qū)邊緣骨硬化，周圍骨質(zhì)疏松，骨小梁排列紊亂，骨質(zhì)溶解破壞，骨膜反應(yīng)較急性期減輕，形成OBD模型（圖3、4）。

綜上所述，該法操作容易掌握，效果明確，為制造Wistar大鼠脛骨骨髓炎骨缺損模型的良好方法。

圖3 骨髓炎骨缺損

圖4 骨髓炎骨缺損外觀

[1]劉玉新，馮秀利，鄒林，等.帶血管局部肌瓣轉(zhuǎn)移治療股骨骨折術(shù)后慢性骨髓炎[J].中華顯微外科，2008，30（31）：138-140.

[2]劉勇.中西醫(yī)結(jié)合治療創(chuàng)傷性骨髓炎的臨床分析[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2012，10（28）：131-132.

[3]譚美蘭.心理護(hù)理干預(yù)對(duì)骨髓炎手術(shù)患者身體恢復(fù)的影響探究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（27）：54-55.

[4]羅德軍，趙宏斌，周旭，等.脈沖沖洗加負(fù)壓封閉引流及開(kāi)放植骨治療慢性骨髓炎[J].中國(guó)骨傷，2010，17（23）：631-633.

[5]劉成龍，郭亭，高杰，等.糖尿病并發(fā)慢性骨髓炎的臨床治療方法探討[J].中國(guó)骨傷，2013，26（2）：165-167.

[6]翟建國(guó)，周碩霞，叢海渡，等.游離皮瓣移植結(jié)合骨段滑移技術(shù)治療脛骨骨髓炎骨缺損[J].中華顯微外科雜志，2012，8（35）：327-329.

[7]劉立峰，鄒林，曹學(xué)成，等.脛骨慢性骨髓炎的顯微外科治療[J].中華顯微外科雜志，2012，33（5）：419-421.

[8]嚴(yán)智文，董河，馮偉，等.改良血管阻塞方法建立大鼠全腦缺血模型[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（1）：1-3.

[9]臧福才，唐偉，白鷹.丁苯酞對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用的研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（9）：15-16.

[10]顧文浩，胡嵐祥，徐祝軍，等.環(huán)扎大鼠脊髓損傷早期不同時(shí)機(jī)減壓后光密度測(cè)量熱休克蛋白70的表達(dá)及其與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（2）：10-12.

[11] Rissing J P，Buxton T B，Weinstein R S，et al.Model of experimental chronic osteomyelitis in rats[J].Infect Immun，1985，53（47）：581-586.

[12] Smeltzer M S，Thomas J R，Hickmon S G，et al.Characterization of rabbit model of staphylococcal osteomyelitis[J].Orthop Res，1997，13（15）：414-421.

[13] Stefan A，Haruo S，F(xiàn)lock J I，et al.Development and characterization of a new model of Hem atogenous osteomyelitis in the rat[J].The Journal of Infectious Disease，1995，96（15）：1230-1236.

[14] Fitzgerald R H.Experimental osteomyelitis： description of a canine model and the role depot administration of antibioties in the prevention and treatment of sepsis[J].Bone and Joint Surg，1983，65-A（3）：371.

[15] Norden C W，Shafferm M. Experimental osteomyelitis due to staphylococcus aureus or pseudomonas aeruginosa： a radiographicpathological correlative analysis[J].Br J Exp Pathol，1980，61（4）：451-460.

Making the Wistar Rats Tibias Osteomyelitic Bone Defect Modal by Staphylococcus Aureus

/LIU Yu-xin，ZHANG Li-yan，TENG Xue-ren，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（21）：031-033

Objective：To observe the effect of making Wistar rats tibias osteomyelitic bone defect by putting a carbasus with Staphylococcus aureus in the bone defection.Method：30 Wistar tibias were divided into 3 groups randomly. The 1stgroup： control group， every tibia was putted bone defect. The 2ndgroup： every tibia was putted a carbasus with staphylococcus aureus （SA） in the bone defect. The 3rdgroup： every rat was used antibiotic therapy after the course of the 2ndgroup. The time of vulnus union， weight， rectal temperature，leuk-analysis，appearance of local tissue condition were compared， the tibias CR at 7 d， 14 d for evaluating the course of osteomyelitic bone defect were observed.Result：Among the 3 group， there were remarkable differences at the the condition of vulnus union，weight，rectal temperature，leukanalysis， appearance of local tissue condition，and tibias CR（P＜0.05）.Conclusion：Putting a carbasus with SA in the bone defection is a good way to make the modal of osteomyelitic bone defect.

Rat； Osteomyelitis； Bone defection

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.21.009

2014-03-26） （本文編輯：蔡元元）

青島市市立醫(yī)院總院長(zhǎng)基金支持課題（ZYZJJ-2013-W017）

①山東省青島市市立醫(yī)院 山東 青島 266071

②山東省東營(yíng)鴻港醫(yī)院

欒艦

First-author’s address：Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266071，China