黃成鋼劉岸唐敏

Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

黃成鋼①劉岸①唐敏①

目的：探討直腸癌組織中生長(zhǎng)激素釋放肽（Ghrelin）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法及Western blot檢測(cè)Ghrelin和MMP-9在21例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及35例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直腸癌組織中的表達(dá)水平的表達(dá)，分析Ghrelin和MMP-9與直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的關(guān)系及兩者的相關(guān)性。結(jié)果：Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為53.57%和80.36%，明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05）；Ghrelin和MMP-9蛋白表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率聯(lián)系密切，并且在直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)增加而增加（P＜0.05）；Ghrelin與MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（κ=0.832，P＜0.001）。結(jié)論：Ghrelin和MMP-9表達(dá)升高與直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)Ghrelin和MMP-9可能對(duì)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后評(píng)估具有重要臨床價(jià)值。

直腸癌； Ghrelin； MMP-9； 淋巴轉(zhuǎn)移

作為消化系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，直腸癌患者的預(yù)后與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。淋巴轉(zhuǎn)移作為直腸癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式，也是影響患者預(yù)后的重要因素，目前尚未有效的預(yù)測(cè)指標(biāo)對(duì)臨床發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的高危人群進(jìn)行篩選，因此，尋找新的可用于臨床診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的分子標(biāo)記，早期發(fā)現(xiàn)并給予早期干預(yù)，對(duì)提高直腸癌患者預(yù)后具有積極的意義。近年來(lái)的研究表明，生長(zhǎng)激素釋放肽（growth hormone releasing peptide，Ghrelin）作為一種生長(zhǎng)激素促泌劑受體的內(nèi)源性配體，可產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在前列腺癌、胃癌和結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2-4]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinases-9，MMP-9）作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族中最重要的蛋白水解酶，在調(diào)控腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[5]。本研究通過(guò)檢測(cè)Ghrelin和MMP-9在21例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直腸癌組織及35例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直腸癌組織中的表達(dá)水平，并分析其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期更好地評(píng)價(jià)直腸癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 56例直腸癌組織標(biāo)本取自2010年1月-2013年1月在本院胃腸外科行手術(shù)切除的直腸癌患者，其中男31例，女25例，年齡24～81歲，中位年齡53歲。所有病例均術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)為直腸腺癌，患者均為首次接受腫瘤手術(shù)治療，術(shù)前均未行放化療。送檢淋巴結(jié)12～45枚，平均（15.21±3.58）枚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以術(shù)后病理檢查為準(zhǔn)，其中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。術(shù)后20 min內(nèi)每份標(biāo)本取材于腫瘤組織和癌旁正常黏膜組織（距腫瘤組織邊緣＞5 cm），迅速分成兩份，分別置于-80 ℃冰箱保存和10%中性甲醛中固定備用。

1.2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率（LNR） 將腫瘤標(biāo)本按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率分為：LNR0（0），LNR1（＜10%），LNR2 （10%～25%），LNR3（＞25%）。LNR=陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)/全部被檢淋巴結(jié)數(shù)×100%。

1.3 試劑 兔抗人Ghrelin多克隆抗體購(gòu)自Sigma公司，兔抗人MMP-9多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，DAB顯色試劑盒和S-P試劑盒均購(gòu)至北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.4 免疫組化檢測(cè)Ghrelin和MMP-9蛋白的表達(dá) 采用S-P法進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，具體步驟：將直腸癌組織標(biāo)本超薄切片后常規(guī)脫蠟，0.3%的H2O2去離子水孵化20 min，經(jīng)抗原修復(fù)后分別加入Ghrelin（工作濃度1：50）和MMP-9（工作濃度為1∶150）在37 ℃下孵育3 h，PBS液沖洗3次；滴加生物素標(biāo)記的二抗在室溫下孵育30 min，PBS液沖洗3次；應(yīng)用DAB顯色劑顯色，經(jīng)充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明和封片。并以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。在直腸癌組織中Ghrelin和MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性。結(jié)果由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片判斷結(jié)果。低倍鏡（×100）下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：（1）無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%計(jì)3分，76%～100%計(jì)4分；（2）著色強(qiáng)度為淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色計(jì)3分。以（1）和（2）的乘積作為評(píng)分，≤3分為陰性，＞3分為陽(yáng)性。

1.5 Western blot檢測(cè)Ghrelin和MMP-9蛋白的表達(dá) 直腸癌標(biāo)本從-80 ℃冰箱內(nèi)取出后，裂解細(xì)胞并分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，用Bradford法測(cè)量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品（20 μg/孔），常規(guī)8% SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入p-AKT一抗（1∶1000）于4 ℃下孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體（1∶2500）室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶暴光強(qiáng)度用Quantity One 4.6.2（BIO，RAD）軟件分析，以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間樣本率比較用 χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析應(yīng)用等級(jí)資料的Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達(dá)情況 如圖1所示，Ghrelin和MMP-9染色陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞核不著色，胞質(zhì)染成棕褐色。在56例直腸癌中，Ghrelin和MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)率分別為53.57%和80.36%，在56例癌旁正常黏膜組織中，Ghrelin和MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)率分別為12.50%和16.07%，Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達(dá)率均明顯高于癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)（P＜0.05）。如表1所示，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性率低的患者相比較，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高的患者中Ghrelin和MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組腫瘤組織切片均以PBS（Phosphate Buffer solution）代替特異性一抗作為空白對(duì)照組，腫瘤組織鏡下均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。

圖1 Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達(dá)（400×）

表1 Ghrelin、MMP-9蛋白在癌旁正常組織及直腸癌組織中的表達(dá) 例

圖2 Western blot檢測(cè)Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達(dá)

2.3 直腸癌中Ghrelin與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性分析在56例直腸癌組織標(biāo)本中，通過(guò)Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示直腸癌組織中Ghrelin的陽(yáng)性表達(dá)與和MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)呈顯著正相關(guān)（κ=0.832，P＜0.001），見(jiàn)表2。

表2 直腸癌中Ghrelin與MMP-9表達(dá)的關(guān)系 例

3 討論

直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響直腸癌患者根治術(shù)后生存率的最重要因素之一，侵襲和轉(zhuǎn)移作為惡性腫瘤的主要生物學(xué)特性，其過(guò)程是是由多種基因調(diào)控共同作用的結(jié)果。直腸癌作為消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，腫瘤轉(zhuǎn)移是判斷患者預(yù)后和確定治療方案的重要依據(jù)，當(dāng)前僅靠單一化驗(yàn)指標(biāo)對(duì)直腸癌患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估的準(zhǔn)確性不高，因此尋求一種新的生物學(xué)標(biāo)志物以期早期發(fā)現(xiàn)及阻斷直腸癌轉(zhuǎn)移，從而提高患者預(yù)后成為當(dāng)前直腸癌的重點(diǎn)研究方向。

Ghrelin是1999年由日本Kojima等發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)激素促泌劑受體的內(nèi)源性配體，為含有28個(gè)氨基酸的活性多肽，其與受體結(jié)合后可產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌、減少脂肪利用、維持能量正平衡[5]。另外，Ghrelin還可促進(jìn)胃酸分泌，增加胃腸蠕動(dòng)和保護(hù)心臟等[6-7]。研究表明，嬰兒和胎兒有大量的Ghrelin生成細(xì)胞，但隨年齡增長(zhǎng)Ghrelin分泌細(xì)胞不斷減少，從而提示Ghrelin與細(xì)胞增殖和分化有一定聯(lián)系[8]。2002年，Riondino等[4]首先報(bào)道Ghrelin與肝癌細(xì)胞的惡性增殖有一定聯(lián)系；在隨后的研究中，更多報(bào)道表明Ghrelin在促進(jìn)多種惡性腫瘤增殖中發(fā)揮了巨大作用[2-3]；另外，在對(duì)結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，Ghrelin不僅與體外惡性腫瘤細(xì)胞侵襲有巨大聯(lián)系，而且與體內(nèi)腫瘤分期有一定聯(lián)系，從而表明Ghrelin與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[9]。在本研究中，Ghrelin在56例直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為53.57%，明顯高于癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)（12.50%），提示Ghrelin的表達(dá)上調(diào)與可能與直腸癌的發(fā)生相關(guān)。同時(shí)對(duì)Ghrelin的表達(dá)與直腸癌臨床病理特征進(jìn)行分析可知，Ghrelin表達(dá)與直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度相關(guān)；另外Ghrelin在直腸癌中的表達(dá)隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加而增加，進(jìn)一步提示Ghrelin在促進(jìn)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了一定的作用，與文獻(xiàn)[4]報(bào)道相符。

在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，金屬蛋白酶家族（MMPs）在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、細(xì)胞外基質(zhì)降解和腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，Ⅳ型膠原酶（MMP-9）作為金屬蛋白酶家族中最重要成員，MMP-9可降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，并促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[10-13]。同時(shí)有研究表明，惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9的能力呈正相關(guān)，從而在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色[14]。在本研究中，筆者采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)MMP-9在直腸惡性腫瘤組織以及癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)，結(jié)果表明，MMP-9在人直腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)，并且MMP-9在直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高的患者中表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)。表明MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)與直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，MMP-9蛋白的表達(dá)可作為判斷直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的參考標(biāo)志物，有助于直腸癌患者預(yù)后的評(píng)價(jià)。筆者在對(duì)Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析可知，Ghrelin的陽(yáng)性表達(dá)同MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)成正相關(guān)，表明Ghrelin 和MMP-9在直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中存在協(xié)同作用，Ghrelin和MMP-9的表達(dá)程度越高，直腸癌越容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究表明Ghrelin和MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)與直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)Ghrelin和MMP-9在直腸癌患者中的表達(dá)可能為腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供一定有價(jià)值的臨床參考，并為下一步探討Ghrelin和MMP-9在直腸癌中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

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The Correlation between Expression of Ghrelin and MMP-9 in Rectal Cancer with Lymph Node Metastasis/

HUANG Cheng-gang，LIU An，TANG Min.//Medical Innovation of China，2014，11（21）：023-026

Objective：To investigate the correlation between the Ghrelin and MMP-9 in rectal cancer tissue with lymph node metastasis.Method：A total of 21 cases of rectal cancer without lymphatic metastasis and 35 cases of rectal cancer with lymphatic metastasis were enrolled in this study.Immunohistochemical staining and western blot were performed to detect the expression of Ghrelin and MMP-9 in the tumor tissues of 56 patients.And statistical analysis technique was used to investigate the relation between their expression and the relationship between the expression of Ghrelin and MMP-9.Result：The expression of Ghrelin and MMP-9 in rectal cancer tissue was 53.57% and 80.36%，respectively，they were significantly highter than that in the adjacent mucosal tissues（P＜0.05）.There were a close correlation between the expression of Ghrelin and MMP-9 with lymph node metastasis rate（P＜0.05）.Furthermore，the positive expression of Ghrelin and MMP-9 increased with increasing lymphatic metastasis.The positive expression of Ghrelin was consistent with the positive expression of MMP-9（κ=0.832，P＜0.001）.Conclusion：Expressions of Ghrelin and MMP-9 are closely related to the degree of lymphatic metastasis of rectal cancer， and their combination may be an important indicator to evaluate the malignant degree and prognosis of the rectal cancer.

Rectal cancer； Ghrelin； MMP-9； Lymphatic metastasis

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.21.007

2014-05-28） （本文編輯：歐麗）

岳陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（【2012】5號(hào)）

①湖南省岳陽(yáng)市一人民醫(yī)院 湖南 岳陽(yáng) 414000

唐敏

First-author’s address：The First People’s Hospital of Yueyang，Yueyang 414000，China