張振濤，張國(guó)新，王洪財(cái)，熊婧，胡丹，張兆輝

腦出血后血腫形成后除占位效應(yīng)損傷周圍腦組織外，還會(huì)通過釋放生物毒性物質(zhì)，產(chǎn)生繼發(fā)性神經(jīng)損傷。腦出血繼發(fā)性神經(jīng)損傷的機(jī)制尚未完全闡明，但目前認(rèn)為蛋白酶活化、紅細(xì)胞破損造成局部鐵超載等因素均參與神經(jīng)損傷過程[1-2]。鈣蛋白酶是體內(nèi)一類重要的蛋白酶，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富。正常情況下，鈣蛋白酶能夠促進(jìn)突觸功能，參與記憶形成。但在疾病狀態(tài)下由于神經(jīng)元鈣超載，導(dǎo)致鈣蛋白酶過度活化。過度活化的鈣蛋白酶通過降解其底物導(dǎo)致神經(jīng)損傷。鈣蛋白酶可降解微管相關(guān)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞骨架損傷[3]；鈣蛋白酶也可降解代謝型谷氨酸受體，使其失去正常功能[4]。另外，鈣蛋白酶還可將P35降解為P25，介導(dǎo)神經(jīng)損傷[5]。但迄今為止，鈣蛋白酶在血腫周圍腦組織繼發(fā)性神經(jīng)損傷的作用尚不明確。本研究利用在體和離體腦出血模型觀察了鈣蛋白酶通過降解其底物突觸蛋白Ⅰ參與神經(jīng)損傷的作用及其機(jī)制，以期為腦出血后繼發(fā)性神經(jīng)損傷尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 鈣蛋白酶抗體和MDL28170購(gòu)自Calbiochem公司，神經(jīng)生長(zhǎng)因子購(gòu)自Sigma公司，鈣蛋白酶抑制劑ALLN購(gòu)自Santa Cruz公司，鈣蛋白酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Abcam公司。立體定向儀購(gòu)自西北光學(xué)儀器廠，大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系（PC12細(xì)胞）由武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物儲(chǔ)藏中心提供。重組突觸蛋白Ⅰ購(gòu)自Novus公司，活化的calpain購(gòu)自Abcam公司，突觸蛋白Ⅰ抗體購(gòu)自Cell Signaling公司。

1.2 自體血注射制作 在體腦出血模型10周齡雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：0 h組（對(duì)照組）、2 h組、12 h組和24 h組，每組10只小鼠。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法制作自體血注射腦出血模型[6]。苯巴比妥（75 mg/kg）麻醉，局部剃毛、消毒。囟門前0.2 mm，側(cè)開2 mm用牙科鉆鉆開顱骨，使用Hamilton注射器向腦內(nèi)注射5 μl自體尾靜脈血，速度為2 μl/min。停針5 min后繼續(xù)進(jìn)針0.7 mm，注射25 μl自體尾靜脈血，停針10 min，緩慢拔針，用骨蠟封閉顱骨破損。分別于術(shù)后2 h、12 h、24 h開顱骨，提取血腫周圍腦組織。0 h組在注射25 μl自體尾靜脈血后立即取注射點(diǎn)周圍腦組織。

1.3 鈣蛋白酶對(duì)重組突觸蛋白Ⅰ的降解 在試管內(nèi)將10 μg純化的重組突觸蛋白Ⅰ（購(gòu)自Novus公司）溶于鈣蛋白酶緩沖液［50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；100 mmol/L NaCl；2 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（edetate disodium，EDTA）；3 mmol/L CaCl2］，然后加入鈣蛋白酶（購(gòu)自Abcam公司），終濃度為5 U/ml。37℃孵育10 min、20 min、30 min后免疫印跡法檢測(cè)突觸蛋白Ⅰ的降解，以0 h的為對(duì)照組，設(shè)定此時(shí)蛋白濃度為100%。

1.4 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 PC12細(xì)胞置于達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（Dulbecco minimum essential medium，DMEM）中，內(nèi)含10%（體積分?jǐn)?shù)）熱滅活小牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml，于5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液。藥物處理前l(fā)周用神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）（終濃度為0.1 μg/ml）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)元樣分化。

1.5 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽染色法檢測(cè)細(xì)胞活力 調(diào)節(jié)PC12細(xì)胞密度約2×105/ml，以100 μl／孔接種于96孔板，分別加入5 U/ml的鈣蛋白酶或鈣蛋白酶抑制劑處理2 h、4 h、8 h和12 h，每種處理設(shè)立6個(gè)復(fù)孔，每孔加5 mg/ml 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽［（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）］10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)基，每孔加二甲基亞砜100 μl，37℃孵育20 min，至顆粒溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm的吸光度值，將其作為反映PC12細(xì)胞活性和代謝狀況的參數(shù)。細(xì)胞存活率=試驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100%。

1.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 收集小鼠腦組織，加細(xì)胞裂解液后在冰上裂解，1300 rpm離心10 min，取上清液，測(cè)定蛋白濃度后聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，然后用鈣蛋白酶抗體4℃孵育過夜，二抗孵育后顯色、曝光。

1.7 鈣蛋白酶活性檢測(cè) 根據(jù)鈣蛋白酶活性檢測(cè)試劑盒說明書，PC12細(xì)胞處理后使用裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清液，蛋白定量后取100 μg蛋白，加入10 μl 10×反應(yīng)緩沖液和5 μl鈣蛋白酶底物，37℃避光反應(yīng)1 h，然后使用400 nm激發(fā)波長(zhǎng)、505 nm發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料如符合正態(tài)分布采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)、四分位數(shù)間距表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 血腫周圍腦組織鈣蛋白酶活性變化及突觸蛋白Ⅰ降解 在顱內(nèi)注射自體血后0 h、2 h、12 h、24 h收集血腫周圍腦組織，檢測(cè)鈣蛋白酶活性，0 h、2 h、12 h、24 h蛋白酶活性讀數(shù)分別為234.32、343.87、425.29和597.36。12 h組和24 h組與0 h組比較差異具有顯著性（P＜0.05）。使用突觸蛋白Ⅰ抗體進(jìn)行免疫印跡檢查發(fā)現(xiàn)，血腫周圍腦組織突觸蛋白Ⅰ水平在血腫形成后逐漸下降，至血腫形成后24 h下降到0 h組的67%（F=8.056，P＜0.01），提示出現(xiàn)突觸蛋白Ⅰ降解（圖1）。

2.2 鈣蛋白酶對(duì)純化的突觸蛋白Ⅰ的降解 體外純化的突觸蛋白Ⅰ與5 U/ml蛋白酶在37℃孵育10 min、20 min、30 min后免疫印跡法檢測(cè)突觸蛋白Ⅰ表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，突觸蛋白Ⅰ水平逐漸下降，提示突觸蛋白Ⅰ被鈣蛋白酶降解。孵育10 min、20 min、30 min后突觸蛋白Ⅰ含量分別下降至對(duì)照組（0 h組）的76.25%（P=0.022）、64.75%（P=0.002）和57.75%（P=0.001）。在鈣蛋白酶抑制劑ALLN（50 μmol/L）和MDL28170（10 μmol/L）存在的情況下，孵育30 min后突觸蛋白Ⅰ分別下降至對(duì)照組的87.00%和84.75%，與單純鈣蛋白酶處理組30 min組相比差異具有顯著性（P＜0.05）。該結(jié)果提示鈣蛋白酶抑制劑能夠抑制鈣蛋白酶對(duì)突觸蛋白Ⅰ的降解（圖2）。

圖1 血腫形成后不同時(shí)間點(diǎn)鈣蛋白酶活性和突觸蛋白Ⅰ表達(dá)變化注：A：鈣蛋白酶活性變化；B：突觸蛋白Ⅰ表達(dá)水平變化。*：與對(duì)照組比較，P＜0.05

2.3 鈣蛋白酶對(duì)神經(jīng)元樣分化的PC12細(xì)胞的損傷作用 PC12細(xì)胞經(jīng)NGF處理后出現(xiàn)神經(jīng)元樣分化，加入外源性鈣蛋白酶5 U/ml后PC12細(xì)胞活力逐漸下降，處理4 h、8 h和12 h后細(xì)胞活力分別下降到對(duì)照組的76%（P=0.002）、69.5%（P＜0.001）和58.25%（P＜0.01）。同時(shí)突觸蛋白Ⅰ水平逐漸降低。鈣蛋白酶抑制劑ALLN（50 μmol/L）處理組細(xì)胞活力升高到對(duì)照組的83%，而MDL28170（10 μmol/L）處理組細(xì)胞活力也升高到對(duì)照組的80.25%（與單純鈣蛋白酶處理12 h組相比，P＜0.01），提示鈣蛋白酶抑制劑具有保護(hù)作用（圖3）。

3 討論

腦出血后血腫周圍神經(jīng)元繼發(fā)性損傷的分子機(jī)制尚未闡明，因此缺乏相應(yīng)的治療方法[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后血腫釋放一系列神經(jīng)損傷因子，主要包括蛋白酶和鐵離子，這些損傷因子導(dǎo)致血腫周圍神經(jīng)元損傷[8]。腦出血后神經(jīng)元鈣超載，可激活一系列鈣離子依賴的神經(jīng)損傷通路[9]。鈣蛋白酶是一種重要的鈣離子依賴的蛋白酶，推測(cè)其可能在腦出血后繼發(fā)性神經(jīng)損傷中發(fā)揮作用。但迄今為止鈣蛋白酶在腦出血后繼發(fā)性神經(jīng)損傷中的作用目前尚不明確[10]。本研究使用自體靜脈血注射制作大鼠腦出血模型，大鼠注射自體靜脈血后均可見到血腫形成，與既往報(bào)道吻合[6]。本研究發(fā)現(xiàn)血腫形成后周圍腦組織鈣蛋白酶活性增高，并通過降解突觸相關(guān)蛋白突觸蛋白Ⅰ促進(jìn)神經(jīng)元損傷。

圖2 活化的鈣蛋白酶降解純化的重組突觸蛋白Ⅰ注：重組突觸蛋白Ⅰ在試管內(nèi)與純化的鈣蛋白酶共同孵育，可見隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，突觸蛋白Ⅰ逐漸被降解。鈣蛋白酶抑制劑ALLN和MDL28170能夠抑制鈣蛋白酶介導(dǎo)的突觸蛋白Ⅰ降解

圖3 鈣蛋白酶及其抑制劑對(duì)細(xì)胞活力和突觸蛋白Ⅰ表達(dá)的影響注：A：鈣蛋白酶及其抑制劑對(duì)細(xì)胞活力的影響；B：鈣蛋白酶及其抑制劑對(duì)突觸蛋白Ⅰ表達(dá)的影響。*：與對(duì)照組（0 h組）比較，P＜0.05；#：與12 h組比較，P＜0.05

鈣蛋白酶是一種鈣離子依賴的蛋白酶，在體內(nèi)參與一系列病理生理過程，包括細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞存活等[11-12]，參與神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、血管內(nèi)徑調(diào)節(jié)等，因此在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用[13]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在腦出血發(fā)生過程中，血腫周圍組織會(huì)出現(xiàn)鈣超載[9]，我們推測(cè)本研究中觀察到的鈣蛋白酶活性增高是由神經(jīng)元鈣超載引起的。鈣離子可直接結(jié)合到鈣蛋白酶的催化中心將其活化[14]，活化的鈣蛋白酶可通過降解其底物發(fā)揮作用。

突觸蛋白Ⅰ是一種突觸前蛋白，可通過控制突觸囊泡的釋放調(diào)節(jié)突觸功能。全長(zhǎng)的突觸蛋白Ⅰ包含5個(gè)結(jié)構(gòu)域，在神經(jīng)元電靜息狀態(tài)下，突觸蛋白Ⅰ存在于突觸囊泡中，維持突觸囊泡的完整性，抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。在神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏挠绊懴?，突觸蛋白Ⅰ被磷酸化，與突觸囊泡脫離接觸，突觸囊泡與突觸前膜融合，將神經(jīng)遞質(zhì)釋放到細(xì)胞外，完成突觸傳遞，然后去磷酸化的突觸蛋白Ⅰ再次募集突觸囊泡，為下一次動(dòng)作電位做準(zhǔn)備[15]。突觸蛋白基因敲除小鼠出現(xiàn)突觸囊泡分布異常、癲癇等病理表現(xiàn)，可見突觸蛋白Ⅰ對(duì)突觸正常功能是必不可少的[16]。

本研究觀察到腦出血周圍組織鈣蛋白酶活性增高，同時(shí)突觸蛋白Ⅰ表達(dá)水平逐漸降低，兩者呈負(fù)相關(guān)。結(jié)合既往研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶可降解突觸相關(guān)蛋白[17]，提示腦出血后活化的鈣蛋白酶可能參與突觸蛋白Ⅰ的降解。為了進(jìn)一步明確鈣蛋白酶和突觸蛋白Ⅰ的直接相互作用，本研究在體外共孵育活化的鈣蛋白酶和純化的重組突觸蛋白Ⅰ不同時(shí)間，以0 h組為對(duì)照組，此時(shí)鈣蛋白酶尚未發(fā)揮作用。發(fā)現(xiàn)活化的鈣蛋白酶可降解突觸蛋白Ⅰ，并且該作用可被鈣蛋白酶特異性抑制劑MDL28170[18]所阻斷。該結(jié)果提示鈣蛋白酶可直接降解突觸蛋白Ⅰ，而不需要其他蛋白酶的參與。既往研究也發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶能夠降低突觸蛋白Ⅰ的半衰期，而鈣蛋白酶抑制劑能夠阻斷突觸蛋白Ⅰ的降解，進(jìn)一步支持本研究的結(jié)果[17]。

突觸蛋白Ⅰ是一種突觸前蛋白，控制突觸囊泡的形成和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，在突觸傳遞中起到關(guān)鍵作用[19]，而且，正常的神經(jīng)傳遞有賴于突觸蛋白的完整性[20]，突觸蛋白Ⅰ被降解破壞后突觸傳遞功能發(fā)生異常。本研究中發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶可降解突觸蛋白Ⅰ，提示鈣蛋白酶對(duì)突觸蛋白Ⅰ的降解可能損傷神經(jīng)元正常突觸功能，破壞神經(jīng)遞質(zhì)的正常釋放和再攝取，加重腦出血后神經(jīng)功能缺失。PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，經(jīng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子處理后表現(xiàn)出神經(jīng)元的特性，如停止分裂增殖、生長(zhǎng)出突起等[21]。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞中，外源性鈣蛋白酶導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，鈣蛋白酶抑制能夠延緩鈣蛋白酶的損傷作用，提示鈣蛋白酶對(duì)神經(jīng)元存在直接損傷作用，既往研究發(fā)現(xiàn)在乳胞素介導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元損傷中，鈣蛋白酶被激活，降解血影蛋白，參與神經(jīng)損傷，而鈣蛋白酶抑制劑具有神經(jīng)保護(hù)作用，該結(jié)果與本研究的結(jié)果相契合[22]。

本研究的不足之處在于并未深入探討鈣蛋白酶的其他底物在腦出血后神經(jīng)元損傷中的作用，因此有必要在突觸蛋白Ⅰ基因敲除小鼠中進(jìn)一步探討鈣蛋白酶對(duì)神經(jīng)元損傷作用的具體機(jī)制。因此，鈣蛋白酶通過降解突觸蛋白Ⅰ導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，參與腦出血后神經(jīng)功能缺失。因此，鈣蛋白酶有望成為腦出血后針對(duì)神經(jīng)損傷的治療靶點(diǎn)。

1 Gao C, Du H, Hua Y, et al. Role of red blood cell lysis and iron in hydrocephalus after intraventricular hemorrhage[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2014, 34:1070-1075.

2 Lauer A, Pfeilschifter W, Schaffer CB, et al. Intracerebral haemorrhage associated with antithrombotic treatment:translational insights from experimental studies[J].Lancet Neurol, 2013, 12:394-405.

3 Bernath E, Kupina N, Liu MC, et al. Elevation of cytoskeletal protein breakdown in aged Wistar rat brain[J]. Neurobiol Aging, 2006,27:624-632.

4 Kataya ma J, Akaike N, Nabekura J.Characterization of pre- and post-synaptic metabotropic glutamate receptor-mediated inhibitory responses in substantia nigra dopamine neurons[J]. Neurosci Res, 2003,45:101-115.

5 Lee MS, Kwon YT, Li M, et al. Neurotoxicity induces cleavage of p35 to p25 by calpain[J].Nature, 2000, 405:360-364.

6 Krafft PR, Rolland WB, Duris K, et al. Modeling intracerebral hemorrhage in mice:injection of autologous blood or bacterial collagenase[J]. J Vis Exp,2012:e4289.

7 Xi G, Keep RF, Hoff JT. Mechanisms of brain injury after intracerebral haemorrhage[J].Lancet Neurol, 2006, 5:53-63.

8 Belur PK, Chang JJ, He S, et al. Emerging experimental therapies for intracerebral hemorrhage: targeting mechanisms of secondary brain injury[J]. Neurosurg Focus,2013, 34:E9.

9 Zheng M, Gong Y, Wang X, et al. Alteration of intracellular calcium and its modulator SLC24A6 after experimental intracerebral hemorrhage[J]. Acta Neurochir Suppl, 2013,118:169-173.

10 Rami A, Krieglstein J. Protective effects of calpain inhibitors against neuronal damage caused by cytotoxic hypoxia in vitro and ischemia in vivo[J]. Brain Res, 1993, 609:67-70.

11 Ono Y, Sorimachi H. Calpains:An elaborate proteolytic system[J]. Biochim Biophys Acta,2012, 1824:224-236.

12 Storr SJ, Carragher NO, Frame MC, et al. The calpain system and cancer[J]. Nat Rev Cancer,2011, 11:364-374.

13 Amini M, Ma CL, Farazifard R, et al.Conditional disruption of calpain in the CNS alters dendrite morphology, impairs LTP,and promotes neuronal survival following injury[J]. J Neurosci, 2013, 33:5773-5784.

14 Moldoveanu T, Hosfield CM, Lim D, et al. A Ca(2+) switch aligns the active site of calpain[J]. Cell, 2002, 108:649-660.

15 Cesca F, Baldelli P, Valtorta F, et al. The synapsins:key actors of synapse function and plasticity[J]. Prog Neurobiol, 2010, 91:313-348.

16 Rosahl TW, Spillane D, Missler M, et al.Essential functions of synapsins I and II in synaptic vesicle regulation[J]. Nature, 1995,375:488-943.

17 Murrey HE, Gama CI, Kalovidouris SA, et al.Protein fucosylation regulates synapsin Ia/Ib expression and neuronal morphology in primary hippocampal neurons[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103:21-26.

18 Gitler D, Xu Y, Kao HT, et al. Molecular determinants of synapsin targeting to presynaptic terminals[J]. J Neurosci, 2004,24:3711-3720.

19 Orlando M, Lignani G, Maragliano L, et al.Functional role of ATP binding to synapsin I in synaptic vesicle trafficking and release dynamics[J]. J Neurosci, 2014, 34:14752-14768.

20 Chi P, Greengard P, Ryan TA. Synaptic vesicle mobilization is regulated by distinct synapsin I phosphorylation pathways at different frequencies[J]. Neuron, 2003, 38:69-78.

21 Chen TI, Chiu HW, Pan YC, et al. Intermittent

【點(diǎn)睛】

本文通過在體和離體模型的研究觀察到鈣蛋白酶通過降解其底物突觸蛋白Ⅰ參與神經(jīng)損傷的作用及其機(jī)制，為腦出血后繼發(fā)性神經(jīng)損傷尋找新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。