劉雅蓉，陳君君，戴 敏，蘇祥飛，葉伊琳

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 省部共建新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室 安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)護理學(xué)院，安徽合肥 230038）

·實驗研究·

丹皮酚通過miR－21介導(dǎo)的p38MAPK信號通路下調(diào)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的大鼠血管內(nèi)皮細胞腫瘤壞死因子－α釋放

劉雅蓉1，陳君君1，戴 敏1，蘇祥飛1，葉伊琳2

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 省部共建新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室 安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)護理學(xué)院，安徽合肥 230038）

目的 觀察微RNA－21（microRNA－21，miR－21）對p38絲裂原活化的蛋白激酶（p38mitogen－activated protein kinase，p38－MAPK）信號通路的調(diào)控作用，探究丹皮酚（paeonol，Pae）抑制血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）損傷的機制。方法 組織塊預(yù)消化貼壁法培養(yǎng)大鼠VEC；氧化低密度脂蛋白（oxidized low－density lipoprotein，ox－LDL）誘導(dǎo)VEC的損傷；用HiPerFect試劑將miR－21模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染進入VEC；免疫印跡法檢測p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達；酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測VEC中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）的水平。結(jié)果 ox－LDL明顯提高VEC中Ras、p－MKK3／6、p－p38蛋白表達水平，并誘導(dǎo)VEC分泌TNF－α；miR－21高表達可升高TNF－α水平及Ras、p－MKK3／6、p－p38蛋白表達水平；Pae明顯降低損傷的VEC分泌TNF－α水平，且抑制由miR－21高表達引起的TNF－α水平上升及p38MAPK信號通路的激活。結(jié)論 Pae可抑制miR－21介導(dǎo)的p38MAPK信號通路，減少ox－LDL誘導(dǎo)的VEC中TNF－α的分泌。

丹皮酚；氧化低密度脂蛋白；血管內(nèi)皮細胞；miR－21；p38MAPK

在動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)生發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）功能失調(diào)和損傷是AS形成的始動環(huán)節(jié)［1］，氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox－LDL）是公認的致VEC損傷的危險性因子之一［2］。微RNA－21（microRNA－21，miR－21）作為一種具有顯著抗癌細胞凋亡作用的特殊微RNA，在腫瘤領(lǐng)域尤其引人關(guān)注。新近發(fā)現(xiàn)，miR－21在心血管領(lǐng)域也具有重要的作用，與血管炎性反應(yīng)密切相關(guān)［3］。本課題組已有研究表明，ox－LDL可以誘導(dǎo)miR－21的表達，造成VEC的炎性損傷，但是，miR－21是否參與調(diào)控VEC的炎性損傷以及其損傷機制尚不清楚。

丹皮酚（paeonol，Pae）是毛茛科植物牡丹Paeonia Suffruticoas Andr.的干燥根皮及蘿摩科植物徐長卿Cynanchum paniculatum（Bge.）Kitag.的干燥根及根莖中的有效成分之一。經(jīng)過大量實驗證實，Pae抑制家兔AS 模型的斑塊局部炎性因子腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor alpha，TNF－α）、白細胞介素－1β（interleukin－1beta，IL－1β）的釋放，減輕斑塊局部炎性反應(yīng)［4］，明顯降低由ox－LDL誘導(dǎo)VEC的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPKs）通路中MAPK8（別名JNK1／2）、MAPK14（別名p38）和MAPK1／3（別名ERK1／2）的磷酸化水平，下調(diào)ox－LDL引起的VEC中miR－21高表達，而Pae對MAPK信號通路的影響及其抗炎作用的發(fā)揮是否與調(diào)控miR－21水平有關(guān)，還需進一步驗證。本實驗以VEC的miR－21為切入點，闡明Pae抗炎作用的分子機制，從而為研究Pae抗AS的新靶點提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 健康Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠，清潔級，體質(zhì)量（160±10）g，安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（皖）2011－0015。

1.2 藥物與試劑 Pae：安徽省宣城百草植物工貿(mào)有限公司生產(chǎn)，純度99％；ox－LDL：廣州奕源生物科技有限公司；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）：美國Gibco公司，批號12000－038；特級胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）：天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司；鼠抗β－actin（批號AP0060）、兔抗Ras抗體（批號BS1788）、兔抗MKK3／6抗體（批號BS1227）、兔抗p－MKK3／6抗體（批號BS6407）、兔抗p38抗體（批號BS1681）、兔抗p－p38抗體（批號BS3736）：美國Bioworld科技公司；辣根過氧化酶（horse－radish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（批號ZB2305）、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號ZB2301）：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（protein molecular weight marker）：美國Thermo公司；p38MAPK抑制劑SB203580：上海碧云天生物技術(shù)研究所；miR－21抑制劑、miR－21模擬物、Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑：德國QIAGEN公司；TNF－α酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：美國Biosource公司。

1.3 主要儀器 MCO－175型CO2培養(yǎng)箱：日本Sanyo公司；SW－CJ－1F型潔凈工作臺：江蘇蘇凈集團安泰公司；CK2型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；ELX800uv酶標(biāo)儀：美國Bio－TEK公司；Hoefer電泳儀：美國Amersham Biosciences公司。

2 方法

2.1 大鼠主動脈VEC的分離、培養(yǎng)與鑒定［5］大鼠處死后，用乙醇浸泡30min，無菌條件下取出胸主動脈放入裝有DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用鑷子小心剝離血管外結(jié)締組織及脂肪組織，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗干凈后，移入另一新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，將血管外翻，使內(nèi)膜暴露，滅菌線將血管兩端折入結(jié)扎，培養(yǎng)液沖洗內(nèi)膜。將血管放入裝有0.2％的Ⅰ型膠原酶的小瓶中，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)消化1h，用含20％FBS的DMEM培養(yǎng)液輕輕漂洗2次，用眼科剪將主動脈血管剪成2mm×2mm小塊，按其內(nèi)膜朝下貼入鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中，并加入1ml含20％FBS的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12h后補加培養(yǎng)液1ml。采用免疫細胞化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化酶連結(jié)法（streptavidin－peroxidase，S－P）鑒定VEC胞漿內(nèi)Ⅷ因子相關(guān)抗原［6］。

2.2 轉(zhuǎn)染miR－21抑制劑或模擬劑 miR－21模擬劑和抑制劑由QIAGEN公司設(shè)計并化學(xué)合成，加入50μl二乙基焦磷酰胺（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水于1nmol模擬劑或抑制劑中，配制成濃度為20μmol／L的溶液，充分混勻，－80℃保存?zhèn)溆?。?～5代VEC，以1×105／ml接種于6孔板中，每孔培養(yǎng)基體積為2ml，置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)試劑盒規(guī)定的轉(zhuǎn)染濃度，取0.6μl miR－21模擬劑和（或）6μl miR－21抑制劑稀釋于400μl無血清培養(yǎng)基中，使其終濃度為5nmol／L，再加入3μl Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑于模擬劑和（或）抑制劑中，渦旋混勻，室溫孵育10min使其形成復(fù)合物。將形成的復(fù)合物滴加入之前接種的細胞中，輕輕晃動6孔板，使復(fù)合物分布均勻，將6孔板置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，24h時更換培養(yǎng)基，進行分組干預(yù)。

2.3 實驗分組及給藥 將VEC以1×105／ml接種于6孔板中。正常對照組：用含20％FBS的正常DMEM培養(yǎng)；ox－LDL組：用含20％FBS的正常DMEM培養(yǎng)24h后，加入終濃度為20μg／ml ox－LDL的DMEM培養(yǎng)24h；miR－21模擬劑組：接種細胞的同時以終濃度為5nmol／L的miR－21模擬劑作用24h，再加入ox－LDL作用24h；miR－21抑制劑組：接種細胞的同時以終濃度為50nmol／L的miR－21抑制劑作用24h，再加入ox－LDL作用24h；Pae組：先加入Pae終濃度為120μmol／L的培養(yǎng)液作用24h，再加入ox－LDL作用24h；Pae＋miR－21模擬劑組：轉(zhuǎn)染miR－21模擬劑后，加入Pae終濃度為120μmol／L的培養(yǎng)液作用24h，再加入ox－LDL作用24h；Pae＋miR－21抑制劑組：轉(zhuǎn)染miR－21抑制劑后，加入Pae終濃度為120μmol／L的培養(yǎng)液作用24h，再加入ox－LDL作用24h；SB203580組：先加入終濃度為20μmol／L的抑制劑SB203580孵育2h，吸棄培養(yǎng)液，再加入ox－LDL作用24h。

2.4 ELISA法檢測TNF－α 吸取上述各組細胞上清液備用。將標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋為40、80、160、320、640ng／L。空白對照孔只加顯色劑A＆B和終止液，其余各步驟操作相同；標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品，50μl鏈霉素－HRP；待測樣品孔：加入各細胞上清液樣品40μl，然后各加入抗TNF－α抗體10μl、鏈霉親和素－HRP 50μl，每組樣品設(shè)置3個復(fù)孔，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60min。經(jīng)過洗滌、顯色及終止反應(yīng)后，采用酶標(biāo)儀在450nm波長下測量各孔的光密度（optical density，OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值計算出對應(yīng)的樣品濃度。

2.5 Western blotting檢測p38MAPK通路蛋白變化 細胞裂解液提取上述各組細胞總蛋白，二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，15％、10％分離膠和5％濃縮膠進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate－polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE），然后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜。5％脫脂奶粉常溫封閉4h后，用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline Tween－20，PBST）洗滌3遍，每次10min。將NC膜放入一抗稀釋液稀釋的一抗中，4℃孵育過夜。用PBST洗3遍，每次10min。加入脫脂奶粉稀釋的二抗IgG－HRP，室溫孵育2h。用PBST洗3遍，每次10min，用化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖片。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，呈正態(tài)分布的連續(xù)型變量以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進行統(tǒng)計學(xué)描述，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 VEC形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 倒置顯微鏡下顯示，原代培養(yǎng)的VEC呈單層鋪路石樣緊密排列，細胞邊緣光滑，胞核清晰。Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定結(jié)果顯示，鏡下細胞胞漿呈棕黃色，即呈陽性反應(yīng)，VEC細胞純度達到95％以上。見圖1。

圖1 VEC形態(tài)學(xué)觀察及鑒定（10×10倍）

3.2 miR－21對TNF－α分泌的調(diào)控 與正常對照組比較，ox－LDL顯著上調(diào)TNF－α的水平（P＜0.01）；與ox－LDL組比較，miR－21模擬劑組TNF－α的水平顯著升高（P＜0.01），miR－21抑制劑組TNF－α的水平顯著降低（P＜0.01）。表明在VEC中，ox－LDL可誘導(dǎo)VEC中TNF－α水平升高，且miR－21高表達可引起TNF－α水平的升高，miR－21的低表達可抑制TNF－α的分泌，即miR－21介導(dǎo)了ox－LDL引起的VEC炎癥因子釋放。見表1。

表1 miR－21對ox－LDL介導(dǎo)的VEC中TNF－α分泌的影響（n＝3，±s）

表1 miR－21對ox－LDL介導(dǎo)的VEC中TNF－α分泌的影響（n＝3，±s）

注：與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；與ox－LDL組比較，＃＃P＜0.01。

組 別TNF－α／（ng／L）351.6±21.4 ox－LDL 467.9±10.8＊＊miR－21模擬劑506.2±24.4＃＃miR－21抑制劑367.1±7.4正常對照＃＃

3.3 miR－21對p38MAPK信號通路的調(diào)控 與正常對照組比較，ox－LDL顯著上調(diào)Ras、p－MKK3／6及p－p38蛋白表達水平（P＜0.01）；與ox－LDL組比較，miR－21模擬劑組Ras、p－MKK3／6及p－p38蛋白表達水平均顯著增高（P＜0.05），miR－21抑制劑組Ras、p－MKK3／6及p－p38蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）。表明ox－LDL可通過上調(diào)miR－21的表達水平激活VEC中p38MAPK信號通路。見圖2、圖3。

圖2 miR－21對p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響（Western blotting法）

圖3 miR－21對p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白相對表達水平的影響

3.4 Pae對miR－21調(diào)控TNF－α水平的影響 與正常對照組比較，ox－LDL組TNF－α水平顯著增加（P＜0.0 1）；與ox－LDL組比較，Pae組、miR－2 1模擬劑＋Pae組、miR－2 1抑制劑＋Pae組以及SB2 0 3 5 8 0組TNF－α水平均顯著降低（P＜0.0 5，或P＜0.0 1）。這些結(jié)果表明Pae可以抑制ox－LDL引起的TNF－α高表達，并且p3 8 MAPK信號通路參與調(diào)控TNF－α的分泌，同時Pae可以反轉(zhuǎn)miR－2 1模擬劑對TNF－α的升高作用，Pae與miR－2 1抑制劑合用更顯著抑制TNF－α的分泌，說明Pae通過調(diào)控miR－2 1的表達水平，進一步抑制TNF－α的分泌。見表2。

表2 Pae對miR－21調(diào)控TNF－α水平的影響（n＝3，±s）

注：與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；與ox－LDL組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組 別TNF－α／（ng／L）361.6±21.4 ox－LDL 467.9±10.8＊＊Pae 355.6±13.9＃＃miR－21模擬劑＋Pae 391.3±18.2＃miR－21抑制劑＋Pae 303.9±16.2＃＃SB203580 372.5±22.3正常對照＃＃

3.5 Pae對miR－21調(diào)控p38MAPK信號通路的影響 與正常對照組比較，ox－LDL組Ras、p－MKK3／6及p－p38蛋白的表達水平顯著增加（P＜0.01）；與ox－LDL組比較，Pae組、miR－21模擬劑＋Pae組、miR－21抑制劑＋Pae組以及ox－LDL＋SB203580組Ras、p－MKK3／6及p－p38蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05，或P＜0.01）。這些結(jié)果表明Pae與SB203580的作用相似，可以抑制p38MAPK信號通路的活化，同時Pae可以反轉(zhuǎn)miR－21模擬劑對p38MAPK信號通路的活化作用，Pae與miR－21抑制劑合用對ox－LDL激活的p38MAPK信號通路有更顯著的抑制作用，進一步說明Pae是通過調(diào)控miR－21的表達水平，抑制p38MAPK信號通路，最終抑制TNF－α的分泌。見圖4、圖5。

圖4 Pae對miR－21調(diào)控p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響（Western blotting法）

4 討論

VEC功能失調(diào)和損傷是AS形成的始動環(huán)節(jié)，而血液中低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）進入內(nèi)皮下被氧化修飾成為ox－LDL是AS發(fā)生發(fā)展過程中最主要的促炎癥因素［7］。本課題組前期研究顯示，ox－LDL與VEC共孵育可使細胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，細胞抑制率明顯上升，表明ox－LDL可導(dǎo)致VEC的損傷與功能失調(diào)［8］，并且ox－LDL刺激濃度為20μg／ml，作用時間為24h時，細胞抑制率達到50％；Pae 60、120、240μmol／L可提高細胞存活率［9］，且當(dāng)濃度為120μmol／L時顯著降低miR－21的表達。故本實驗選用ox－LDL 20μg／ml作用24h誘導(dǎo)VEC損傷體外細胞模型，選用Pae 120μmol／L預(yù)保護24h進行分子機制研究。

圖5 Pae對miR－21調(diào)控p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白相對表達水平的影響

微RNA（microRNAs，miRs）是一類由內(nèi)源基因編碼的18～22個堿基長度的非編碼單鏈RNA分子，與細胞炎性反應(yīng)關(guān)系密切，并發(fā)展為人類疾病的診斷和治療的一種新方法［10－11］。其中，miR－21在心腦血管疾病中，特別是AS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［12］。研究表明，miR－21在人臍靜脈內(nèi)皮細胞和損傷的大鼠VEC中均有較高表達［13］，并參與內(nèi)膜的修復(fù)，miR－21的下調(diào)則會引起新生內(nèi)膜的形成減少［14］。從課題組前期實驗結(jié)果得知，ox－LDL可以顯著上調(diào)VEC中miR－21表達，在本研究中，miR－21的高表達可引起TNF－α水平的升高，miR－21的低表達可抑制TNF－α的分泌，說明miR－21介導(dǎo)ox－LDL引起的VEC炎性因子釋放。而前期研究已表明，Pae可以下調(diào)VEC中ox－LDL引起的miR－21高表達，結(jié)合本實驗結(jié)果，進一步提示，Pae通過調(diào)控miR－21的表達水平，抑制ox－LDL誘導(dǎo)的TNF－α表達。

miR－21可以通過mRNA剪切和抑制蛋白翻譯的方式負調(diào)控靶基因［15］，大量研究表明磷酸酶和張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是miR－21的下游靶基因［16－18］，編碼的PTEN蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性，可與酪氨酸和絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶競爭共同底物，使自身去磷酸化，從而抑制酪氨酸和絲氨酸／蘇氨酸介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。p38MAPK信號通路是酪氨酸和蘇氨酸介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與炎性反應(yīng)密切相關(guān)［19］，其級聯(lián)反應(yīng)由Ras、MKK3／6和p38MAPK 3種激酶構(gòu)成一個連續(xù)的蛋白激酶反應(yīng)鏈。miR－21的高表達負調(diào)控PTEN基因，使PTEN蛋白水平下降，導(dǎo)致p38MAPK信號通路激活，活化的p38MAPK通過上調(diào)某些轉(zhuǎn)錄因子基因的表達和生物活性，影響細胞炎性反應(yīng)，使細胞因子如TNF－α大量釋放［20］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，miR－21可以調(diào)控p38MAPK信號通路的傳導(dǎo)，影響炎性因子TNF－α的釋放。Pae可能通過下調(diào)miR－21水平，抑制p38MAPK信號通路，最終減少炎性因子TNF－α的釋放。

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Paeonol Reduces Release of TNF－αin Vascular Endothelial Cells Induced by Oxidized Low－Density Lipoprotein through microRNA－21－mediated p38 MAPK Pathway

LIU Ya－rong1，CHEN Jun－jun1，DAI Min1，SU Xiang－fei1，YE Yi－lin2
（1.School of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine ＆Key Laboratory of Xin'an Medicine Jointly Supported by Ministry of Education and Anhui Province ＆Anhui Province Key Laboratory of Reserch and Development of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230031，China；2.School of Nursing，Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China）

Objective To observe the regulatory effect of microRNA－21（miR－21）on the p38mitogen－activated protein kinase（p38MAPK）pathway and to investigate the molecular mechanism by which paeonol（Pae）inhibits injury of vascular endothelial cells（VECs）.Methods VECs were isolated from rat thoracic aortas by collagenase digestion and adherent culture and then injured by oxidized low－density lipoprotein（ox－LDL）；the cells were transfected with miR－21 mimic or inhibitor using a HiPerFect transfection reagent.The protein expression of Ras，p－MKK3／6，and p－p38was measured by Western blotting；the level of tumor necrosis factor－α（TNF－α）in VECs was measured by enzyme－linked immunosorbent assay.Results The ox－LDL significantly increased the protein expression of Ras，p－MKK3／6，and pp38and induced secretion of TNF－αin VECs.Enhanced miR－21expression increased the level of TNF－αand protein expression of Ras，p－MKK3／6，and p－p38.Pae significantly reduced the release of TNF－αin injured VECs and inhibited the increase in TNF－αlevel and activation of p38MAPK pathway caused by enhanced miR－21expression.Conclusion Pae can inhibit the miR－21－mediated p38MAPK pathway and reduce ox－LDL－induced release of TNF－αin VECs.

paeonol；oxidized low－density lipoprotein；vascular endothelial cell；microRNA－21；p38MAPK

R285.5

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.01.020

2013－11－26）

國家自然科學(xué)基金項目（81073090，81274134）；安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生科技創(chuàng)新基金（2013zd003）

劉雅蓉（1989－），女，碩士研究生

戴敏，daiminliao＠163.com