朱 艷

（安徽中醫(yī)藥大學附屬針灸醫(yī)院，安徽合肥 230061）

刺血加艾灸療法對急性痛風性關節(jié)炎大鼠外周血單個核細胞TLR2與TLR4mRNA表達的影響

朱 艷

（安徽中醫(yī)藥大學附屬針灸醫(yī)院，安徽合肥 230061）

目的 探究刺血加艾灸療法治療急性痛風性關節(jié)炎的作用機制。方法 將40只Wistar雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型組、秋水仙堿組、刺血艾灸組，每組10只，采用尿酸鈉混懸液右后踝關節(jié)注射法復制痛風性關節(jié)炎大鼠模型。分別在模型復制時、模型復制后24h及灌胃治療后3d測量右后足腫脹度；灌胃3 d后，從腹主動脈取血，檢測血清尿酸（uric acid，UA）含量及外周血單個核細胞中Toll樣受體2（toll－like receptor 2，TLR2）和Toll樣受體4（toll－like receptor 4，TLR4）mRNA的表達水平。結果 與正常對照組比較，模型組大鼠足腫脹度，血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達水平均顯著上調（P＜0.01）。刺血艾灸組足腫脹度，血清UA含量，TLR2、TLR4mRNA表達水平較模型組均顯著下調（P＜0.05，或P＜0.01），且顯著低于秋水仙堿組（P＜0.05，或P＜0.01）。結論 刺血加艾灸療法能夠降低痛風性關節(jié)炎大鼠的關節(jié)腫脹度及血清UA水平，其機制可能與外周血單個核細胞中TLR2與TLR4mRNA的表達水平下調有關。

痛風性關節(jié)炎；刺血；艾灸；Toll樣受體；尿酸

痛風是由嘌呤代謝紊亂，血尿酸增高，導致尿酸結晶沉積在關節(jié)及皮下組織而引起的一種疾病。臨床上以高尿酸血癥、特征性急性關節(jié)炎、痛風結石形成為特點。痛風性關節(jié)炎就是由痛風引起的發(fā)病急驟的關節(jié)紅腫和劇痛的關節(jié)炎癥，受累關節(jié)疼痛難忍，活動受限，易反復發(fā)作。近年來，由于飲食結構變化，中國痛風發(fā)病率逐年升高，預計在21世紀，痛風在中國將成為僅次于糖尿病的第二號代謝?。?］。Toll樣受體（toll－like receptors，TLRs）是連接固有免疫和適應性免疫的橋梁，其中TLR2與TLR4在急性痛風性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，已成為目前研究急性痛風性關節(jié)炎的熱點。刺血療法和灸法屬于中醫(yī)傳統外治法，刺血療法針刺局部可以促進和改善局部血液循環(huán)，加速炎性滲出物和致痛物質的吸收，緩解疼痛，使致痛因子盡早排除，促進經絡修復。灸法具有溫經、活血通絡、清熱解毒等功效，并且治療過程中患者有舒適感，因此很受患者歡迎。本研究旨在觀察刺血加艾灸療法對急性痛風性關節(jié)炎大鼠TLR2與TLR4的調節(jié)作用。

1 材料

1.1 動物 清潔級Wistar雄性大鼠40只，體質量（200±20）g，由安徽省醫(yī)學科學研究所動物房提供（合格證號：皖醫(yī)實動準字03號）。實驗室保持恒溫、恒濕，動物在明暗周期各12h（明期6：00— 18：00）的條件下進行適應性飼養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑 秋水仙堿：每片0.5mg，吉林省通化百信藥業(yè)有限公司生產，用生理鹽水配成0.0135mg／ml的混懸液，備用。艾條：上海泰成科技發(fā)展有限公司。尿酸鈉：由美國Sigma公司出品，批號127k7331。Trizol提取液：天根生化科技（北京）有限公司提供，批號DP517；PCR Master Mix試劑盒（貨號K0171）、M－Mulv Reverse試劑盒（貨號K1624）：均購自加拿大Fermentas公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。RIPA裂解液購自江蘇碧云天生物技術研究所（貨號p0017B）。

1.3 儀器與設備 Penguin－600CL－OYLMPUS BX51圖像分析系統：美國BIOPAC公司；PH070Am電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；Centrifuge 5417R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf；EPS－301電泳儀：美國Amersham公司；Gel Doc XR凝膠圖像分析儀：美國Bio－RAD公司。

2 方法

2.1 模型復制方法［2］將大鼠右后踝關節(jié)屈曲，用手觸摸，可捫及兩骨突部，局部無菌操作后，用6號注射針自兩骨突間進針，感覺有突破感后，證明針頭進入踝關節(jié)內，注入0.2ml尿酸鈉混懸液（濃度為100mg／ml），正常對照組注入等量生理鹽水。注射尿酸鈉混懸液24h后，觀察右后踝關節(jié)，如有明顯腫脹，即表明模型復制成功。

2.2 分組及給藥 適應性喂養(yǎng)1周后，40只大鼠隨機分為正常對照組、模型組、秋水仙堿組、刺血艾灸組，每組10只，后3組大鼠均進行模型復制。模型復制24h后對各組大鼠進行治療。分組治療3d，所有動物均在上午10：00—11：00定時治療。各組均自由飲水和普食飼養(yǎng)。

2.2.1 秋水仙堿組［3］：先將秋水仙堿碾磨成粉，然后將其溶于生理鹽水中以制成混懸液，每日按0.135 mg／kg劑量灌胃，共灌胃治療3d。

2.2.2 刺血艾灸組：于右后踝關節(jié)最腫處去除周圍皮毛，常規(guī)無菌操作后，以三棱針點刺，擠出血3～5滴，然后將大鼠仰臥位束縛在大鼠固定木板上，將艾條固定在自制艾灸架上，艾條點燃部位離穴位約3cm，每次10min左右，以局部皮膚潮紅為度，每日1次，共3d。

2.2.3 正常對照組和模型組：予等量生理鹽水灌胃，10ml／kg，每日1次，共3d。

2.3 觀測指標與方法

2.3.1 一般觀察：觀察大鼠的外觀、性情、活動等情況。

2.3.2 右后足腫脹度：試驗前每只大鼠右后足踝關節(jié)處用記號筆作一清晰橫線，分別于模型復制時、模型復制后24h及治療后3d用自制容積測定儀［4］測量大鼠足趾容積。給藥前腫脹度＝（給藥前足容積－致炎前足容積）／致炎前足容積×100％，給藥后腫脹度＝（給藥后足容積－給藥前足容積）／給藥前足容積×100％。

2.3.3 血清尿酸（uric acid，UA）水平檢測：末次治療24h后，用20％烏拉坦溶液按0.5ml／kg劑量予腹腔內注射麻醉后，仰位固定。從腹主動脈取血約2ml，4 000r／min離心10min，取血清，采用酶比色法檢測UA水平。

2.3.4 RT－PCR法檢測TLR2、TLR4mRNA表達：末次治療24h后，用20％烏拉坦溶液按0.5 ml／kg劑量予腹腔內注射麻醉后，仰位固定。從腹主動脈取血約2ml，置枸櫞酸鈉抗凝試管內，分離外周血單個核細胞，重懸于RPMI－1640培養(yǎng)基，置12孔塑料皿內，于37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min后，Trizol法提取外周血單個核細胞的總RNA，生物紫外分光光度計測定RNA的純度和總量。根據Gene Bank提供的引物序列，使用Primer 5軟件設計并分析引物。以此RNA為模板，加入2.5mmol／L olig（dT）18及莫洛尼氏鼠白血病毒逆轉錄酶（moloney murine leukemia virus reverse transcriptase，M－MLV RT）。TLR2mRNA與TLR4mRNA擴增條件：94℃預變性2min，然后進行循環(huán)擴增，即97℃變性1.5min→56℃退火1 min→72℃延伸1min，循環(huán)次數分別為35、32次，最后再72℃延伸10min。內參擴增條件：94℃預變性2min，然后進行循環(huán)擴增，即95℃變性1.5 min→56℃退火1min→72℃延伸1min，循環(huán)36次，最后再72℃延伸10min。反應產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳進行分析。引物序列及反應條件、擴增長度見表1。采用Image－pro plus軟件對條帶進行分析，計算電泳條帶的累積光密度（integral optical density，IOD），以TLR2、TLR4與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide－adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的IOD比值作為TLR2mRNA及TLR4mRNA表達的相對含量。

表1 各引物序列、反應條件、循環(huán)次數和擴增長度

2.4 統計學方法 采用SPSS 17.0進行統計學處理，連續(xù)性變量采用“均數±標準差（±s）”進行統計學描述，等級資料采用秩和檢驗，兩組間均數比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett T3法（方差不齊）。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況觀察 實驗期間，正常對照組大鼠行動靈活，反應靈敏。模型組大鼠出現關節(jié)腫脹，精神不振，患肢屈曲因痛不能著地。刺血艾灸組和秋水仙堿組大鼠精神狀態(tài)明顯好轉，致炎關節(jié)腫脹明顯減退，其中刺血艾灸組好轉更為明顯。

3.2 各組大鼠足趾腫脹度比較 致炎前各組大鼠足跖腫脹度無明顯差異（P＞0.05）；模型復制后24 h，模型組、刺血艾灸組、秋水仙堿組大鼠足跖腫脹度顯著高于正常對照組（P＜0.01）；治療后3d，刺血艾灸組和秋水仙堿組大鼠足跖腫脹度較模型組顯著減輕（P＜0.01），刺血艾灸組大鼠關節(jié)腫脹度顯著低于秋水仙堿組（P＜0.01）。見表2。

3.3 各組大鼠血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達水平比較 與正常對照組相比，模型組血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，刺血艾灸組和秋水仙堿組血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達水平顯著下降（P＜0.05，或P＜0.01）；刺血艾灸組血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達水平顯著低于秋水仙堿組（P＜0.05，或P＜0.01）。見表3、圖1。

表2 各組大鼠足趾腫脹度比較（±s）

表2 各組大鼠足趾腫脹度比較（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與秋水仙堿組比較，＃＃P＜0.01。

組 別n足趾腫脹度／％ 3d正常對照模型復制前模型復制后24h治療后10 1.93±0.22 2.14±0.27 2.45±0.14模 型10 1.94±0.20 15.05±0.61＊＊14.55±0.61＊＊秋水仙堿10 1.94±0.18 14.97±0.51＊＊10.59±0.71＊＊△△刺血艾灸10 1.95±0.22 14.63±0.51＊＊6.61±0.87＊△△＃＃

表3 各組大鼠血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清UA含量及TLR2、TLR4mRNA表達水平比較（±s）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與秋水仙堿組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組 別n TLR2mRNA TLR4mRNA UA／（μmol／L）正常對照10 0.46±0.06 0.37±0.05 78.18±6.66模 型10 0.89±0.05＊＊0.80±0.05＊＊122.63±8.62＊＊秋水仙堿10 0.68±0.05＊＊△△0.68±0.06＊104.08±7.20＊＊△△刺血艾灸10 0.51±0.05＊＊△△＃＃0.53±0.07＊＊△△＃86.63±8.78＊△△△＃

圖1 各組大鼠TLR2和TLR4mRNA表達水平比較（M.NADPH；a.正常對照組；b.模型組；c.刺血艾灸組；d.秋水仙堿組）

4 討論

炎性細胞、細胞因子及炎性體對于痛風性關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展直至自然緩解具有重要意義，其中炎性體包括細胞內大分子、多蛋白復合體，能夠激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－1，促進促炎因子白細胞介素－1β（interleukin－1beta，IL－1β）和IL－18的加工和成熟，引起細胞死亡。TLRs是與痛風關系密切的細胞因子，是模式識別受體的一種，在抗感染免疫中首先被人們認識，其在固有免疫和炎性細胞因子的產生及信號傳遞過程中發(fā)揮重要作用，其中TLR2和TLR4協同鏈接蛋白髓樣分化因子識別尿酸鹽結晶，從而啟動細胞信號級聯放大，最終激活一系列促炎細胞因子和啟動適應性免疫應答，這也是痛風發(fā)作的病理學標志［5］。近期研究發(fā)現，痛風急性發(fā)作期體內TLR2和TLR4的表達水平明顯升高，而采用抗炎、調節(jié)免疫等干預治療后則TLR2、TLR4表達水平明顯下調［6］，這與針對敲除TLRs基因的缺陷鼠的研究結果相一致［7］。

痛風性關節(jié)炎屬中醫(yī)學“歷節(jié)”“白虎歷節(jié)風”“痹病”范疇?！夺樉拇蟪伞分^其“病有三因，皆從氣血”，《千金方》認為其病因為“熱毒氣從臟腑出，攻于手足”，朱丹溪在《格致余論》中指出痛風是“血中有熱，再受風寒，熱血得寒，痰濁凝澀引起”，這些均說明急性痛風性關節(jié)炎與血中瘀熱有關。

中醫(yī)學早已論及刺血療法的作用機制?！端貑枴ふ{經論》認為：“血有余，則瀉其盛經，出其血，視其血絡，刺出其血，惡血得入于經，以成其疚”；“病在脈，調之血；病在血，調之絡”。《靈樞·小針解》：“除之者，去血脈也?！薄端貑枴め樈狻氛f：“除之，出惡血也，邪勝則虛之，出針勿按?！笔柜弊桁畛庋〞?，以達到治療目的。中醫(yī)學認為艾屬溫性，其味芳香，善通十二經脈，具有理氣血、逐寒濕、溫經、解毒等作用。在艾灸治療過程中，艾葉燃燒后產生的溫熱效應滲透諸經，起到治療作用。刺血及艾灸療法現已被臨床認可，尤其在治療痛風性關節(jié)炎方面療效確切［8－11］。

本研究結果提示：刺血加艾灸療法能夠緩解急性痛風性關節(jié)炎大鼠關節(jié)疼痛，改善關節(jié)腫脹度，下調尿酸水平，其機制可能與其下調TLR2和TLR4 mRNA表達水平有關。

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［3］許延文.痹清膠囊抗痛風作用的實驗研究［D］.哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學，2005：35.

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Effects of Moxibustion Combined with Blood－pricking Therapy on mRNA Expression of Toll－like Receptor 2 and Toll－like Receptor 4in Peripheral Blood Mononuclear Cells among Rats with Acute Gouty Arthritis

ZHU Yan
（The Acupuncture and Moxibustion Hospital Affiliated to Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230061，China）

Objective To investigate the action mechanism of moxibustion combined with blood－pricking therapy in the treatment of acute gouty arthritis.Methods Forty male Wistar rats were randomly and equally divided into normal control group，model group，colchicine group，and moxibustion／blood－pricking therapy group.A rat model of gouty arthritis was induced by injecting sodium urate suspension（0.2ml）into the right hind ankle joint.The degree of swelling of right hind foot was determined based on the toe volumes measured when the model was induced，at 24hafter the model was induced，and after 3dof treatment.Three days after treatment，blood samples were taken from the abdominal aorta，and the serum uric acid（UA）level and mRNA expression of Toll－like receptor 2（TLR2）and Toll－like receptor 4（TLR4）in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）were measured.Results Compared with the normal control group，the model group had significantly increased foot swelling，serum UA level，and mRNA expression of TLR2and TLR4（P＜0.01）.Compared with the model group and colchicine group，the moxibustion／blood－pricking therapy group had significantly reduced foot swelling，serum UA level，and mRNA expression of TLR2and TLR4（P＜0.05or P＜0.01）.Conclusion Moxibustion combined with blood－pricking therapy can reduce joint swelling and serum UA level in rats with gouty arthritis，which may be related to down－regulated expression of TLR2and TLR4in PBMCs.

gouty arthritis；blood－pricking therapy；moxibustion；Toll－like receptor；uric acid

R684.3

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.01.019

2013－07－21）

安徽中醫(yī)學院青年科學基金項目（2012qn042）

朱艷（1977－），女，博士，主治醫(yī)師