金永男竇宇聶俊杰許秉全

188Re放射性錫膠體對惡性腹水模型小鼠的治療作用

金永男①竇宇②聶俊杰①許秉全①

目的：探討和評價188Re（錸）標記的錫膠體對惡性腹水動物模型的治療效果。方法：制備188Re-錫膠體按試劑盒說明書操作，標記率通過色譜法利用放射性薄層掃描儀檢測。在體外培養(yǎng)小鼠肉瘤180細胞5×106/0.3 mL注射到ICR小鼠腹腔內(nèi)建立惡性腹水動物模型。培養(yǎng)3 d后實驗組分3個劑量組，分別為188Re-錫膠體37組、18.5組和9.25 MBq/mL組。對照組為惡性腹水小鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水組、正常ICR小鼠腹腔內(nèi)注射37 MBq/mL 188Re-錫膠體組和正常ICR小鼠組，每組均12只。注射錫膠體3、24 h和48 h后用γ相機分不同時間采集小鼠腹腔內(nèi)放射性分布圖像，然后收集腹腔積液通過免疫印跡法檢測Bax蛋白的表達情況，同時取腹腔主要臟器評價腹腔臟器的組織病理學變化。注射錫膠體后每隔2 d進行體重和生存時間的監(jiān)測，共觀察80 d。統(tǒng)計學處理采用SPSS 10.7版軟件進行統(tǒng)計學分析，生存時間分析采用kaplan meir統(tǒng)計學方法，組間比較采用log Rank方法。結(jié)果：188Re-錫膠體的標記效率均為99%以上。注射錫膠體3、24 h和48 h后用γ相機采集的小鼠腹腔內(nèi)放射性分布圖像顯示，放射性膠體均勻分布在小鼠腹腔內(nèi)無腹腔外漏出。188Re-錫膠體處理的實驗組與生理鹽水處理的對照組相比腫瘤細胞Bax蛋白的表達明顯增加；腹腔臟器的組織病理學檢測結(jié)果也顯示，188Re-錫膠體處理的小鼠與生理鹽水處理的小鼠相比，出現(xiàn)肝細胞變性，脾白髓萎縮，中性粒細胞浸潤，腸細胞粘連，胃腺體退化等改變。注射37 MBq/mL 188Re-錫膠體的兩組小鼠初期與其他各組相比具有體重下降趨勢，但隨后8～10 d開始體重逐漸增加，各組間未見明顯差異（P＞0.05）。188Re-錫膠體注射后80 d生存率分析結(jié)果顯示，37、18.5和9.25 MBq實驗組生存時間分別為（59.0±8.5）d、（63.6±7.1）d、（54.8±7.0）d，與生理鹽水組（20.0±1.9）d相比，均明顯延長（P＜0.001）。結(jié)論：188Re標記的放射性錫膠體不僅物理性能好，而且對惡性腹水療效佳，副反應小，為臨床治療惡性胸、腹水提供了更多的選擇。

惡性腹水； 188Re-錫膠體； 動物模型

惡性腹水是消化系統(tǒng)腫瘤或卵巢癌等通過血管和淋巴管發(fā)生轉(zhuǎn)移、腫瘤組織潰破漿膜層或根治術(shù)后也常因癌細胞脫落腹腔發(fā)生種植性轉(zhuǎn)移。一般患者出現(xiàn)惡性腹水時多為癌癥中晚期、體質(zhì)較差，外科手術(shù)、全身化療和放療效果也不理想。放射性核素標記的膠體腹腔內(nèi)灌注治療惡性腹水具有療效好、持續(xù)時間長和副作用小等特點，廣泛應用于臨床[1-4]。常用的放射性膠體是198Au和32P標記的放射性膠體，然而放射性核素198Au和32P的物理特征不適合臨床應用。放射性核素188Re半衰期17 h，發(fā)射高密度的高能β射線（Emax=2.12 MeV），其組織內(nèi)平均射程為3.8 mm，而且利用它發(fā)射（15%、155 KeV）的γ光子，通過ECT等顯像設備獲得體內(nèi)放射性膠體的分布圖像。無載體188Re可以從188W/188Re核素發(fā)生器獲得，更適合臨床使用[5-10]。因此，188Re標記的治療用放射性藥物的研究逐漸增加，有些藥物已應用于肝癌、關節(jié)炎和骨轉(zhuǎn)移癌的治療[11-15]。188Re標記的腔內(nèi)治療用放射性膠體有硫膠體和錫膠體。然而，有研究報道稱，188Re標記的硫膠體在使用過程中，注射器或其他管壁殘留放射性較高，使得難以預測注射劑量，并導致產(chǎn)生多余的放射性廢物[12]。因此，本實驗通過建立惡性腹水的動物模型，利用188Re標記的錫膠體評價其惡性腹水的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠肉瘤180細胞、188Re-錫膠體試劑盒（韓國首爾大學醫(yī)科大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科實驗室提供）；ICR小鼠（日本SLC提供）；188W/188Re核素發(fā)生器（美國橡樹嶺國家實驗室提供）；放射性薄層掃描儀（美國Imaging Scanner system 2000，BIOSCAN）；Bax抗體（美國Santa Cruz Biotech公司）；γ相機（美國ON 410；Ohio Nuclear）。

1.2 方法

1.2.1 制備188Re 錫膠體 188Re-錫膠體標記按說明書操作，將從188W/188Re核素發(fā)生器淋洗下來的新鮮188Re淋洗液（～1110 MBq）、0.1 mol/L HCl 0.2 和0.8 mL的分別加到小瓶中，并沸水孵育2 h，冷卻后用0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH=8）進行中和，離心棄去上清液加生理鹽水。標記率通過色譜法（ITLC-SG/生理鹽水）利用放射性薄層掃描儀檢測。放射性膠體顆粒大小和穩(wěn)定性由國立首爾大學醫(yī)科大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科預先進行檢測[12]。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將肉瘤180細胞接種于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.3 動物模型的建立及實驗分組 在體外培養(yǎng)的肉瘤180細胞5×106/0.3 mL注射到ICR小鼠腹腔內(nèi)，3 d 后188Re-錫膠體注入到ICR小鼠腹腔內(nèi)。其劑量按每30 g體重ICR小鼠分別為37、18.5和9.25 MBq/mL，每組均12只。對照組分別為惡性腹水小鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水組（第4組）、正常ICR小鼠腹腔內(nèi)注射37 MBq/mL 188Re-錫膠體組（第5組）和正常ICR小鼠（第6組），每組均12只。

1.2.4 圖像采集 小鼠腹腔內(nèi)注射錫膠體3、24和48 h后，使用針孔準直器的γ相機，不同時間采集小鼠腹腔內(nèi)放射性分布圖像。

1.2.5 Bax蛋白的檢測及腹腔臟器組織病理學檢測 收集腹腔積液按常規(guī)免疫印跡法檢測Bax蛋白的表達情況，同時取腹腔主要臟器檢測腹腔臟器的組織病理學變化。

1.2.6 療效評價 小鼠腹腔內(nèi)注射188Re-錫膠體后，每隔2 天進行體重和生存時間的監(jiān)測，共觀察80 d。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.7版軟件進行統(tǒng)計分析，生存時間分析采用kaplan meir統(tǒng)計學方法，組間比較采用log Rank方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 標記率及穩(wěn)定性 188Re-錫膠體的標記效率均為99%以上。預先檢測的188Re-錫膠體的穩(wěn)定性，無論在體外常溫下放置24 h還是37 ℃血清培養(yǎng)液放置72 h，其放射化學純度未見變化。

2.2 放射性膠體腹腔內(nèi)分布圖像 注射錫膠體3、24 和48 h后用γ相機采集的小鼠腹腔內(nèi)放射性分布圖像，發(fā)現(xiàn)放射性膠體均勻分布在小鼠腹腔內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)明顯的腹腔外放射性分布（圖1）。

圖1 腹腔內(nèi)注射188Re-錫膠體后不同時間段獲得的188Re-錫膠體腹腔內(nèi)膠體分布圖像

2.3 Bax蛋白檢測及腹腔臟器組織病理學檢測 188Re-錫膠體處理的實驗組與生理鹽水處理的對照組相比，腫瘤細胞Bax蛋白的表達明顯增加（圖2）；腹腔臟器的組織病理學檢測結(jié)果也顯示，188Re-錫膠體處理的小鼠與生理鹽水處理的小鼠相比，出現(xiàn)肝細胞變性，脾白髓萎縮、中性粒細胞浸潤，腸細胞粘連，胃腺體退化等改變。

圖2 惡性腹水小鼠模型腹腔內(nèi)注射188Re-錫膠體48 h后通過免疫印跡法檢測腫瘤細胞內(nèi)Bax蛋白的表達情況

2.4 療效評價 注射37 MBq 188Re-錫膠體的兩組小鼠體重初期與其他各組相比，體重有下降趨勢，但隨后8～10 d開始體重逐漸增加，各組間未見明顯差異（圖3）。188Re-錫膠體注射后80 d生存率分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，37、18.5和9.25 MBq實驗組生存時間分別為（59.0±8.5）d、（63.6±7.1）d、（54.8±7.0）d，與生理鹽水組（20.0±1.9）d相比，均明顯延長（P＜0.001），見圖4。

圖3 惡性腹水小鼠模型腹腔內(nèi)注射188Re-錫膠體后實驗及對照組小鼠體重變化情況

3 討論

放射性核素標記的膠體廣泛應用于類風濕關節(jié)炎、惡性腹水和胸腹腔內(nèi)微小轉(zhuǎn)移灶的預防與治療[1-8]。放射性膠體屬惰性物質(zhì)，本身無藥理作用。注入體內(nèi)后不溶解于體液，因而不被吸收，大部分停留在注射部位，或均勻地附著在體腔內(nèi)壁和腫瘤組織表面，或被腫瘤近旁淋巴管及淋巴結(jié)中的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬細胞所吞噬，使放射性膠體較多地濃聚在腫瘤病灶中或其周圍。標記核素放出的β射線近距離照射可對滲出液內(nèi)的游離癌細胞和散播在漿膜表面的微小病灶進行照射，直接殺死癌細胞，也能直接破壞漿膜表面粟粒樣轉(zhuǎn)移灶使其趨向纖維化，還可促使內(nèi)皮下層纖維化，局部血管和淋巴管閉塞，以及漿膜臟層和壁層黏合而使?jié)B出液減少。但對鄰近器官無明顯影響，很少出現(xiàn)全身反應，可提高患者生活質(zhì)量并延長生存時間[2，16]。

圖4 惡性腹水小鼠模型腹腔內(nèi)注射188Re-錫膠體后實驗及對照組小鼠的生存曲線

然而，放射性膠體顆粒大小和核素的物理特征直接影響腹腔內(nèi)放射性膠體的生物分布和療效。本研究所使用的188Re-錫膠體發(fā)射高密度高能β射線以及適合ECT顯像的γ射線，而且膠體顆粒大?。ǎ? μm，占94.8%）也適合腔內(nèi)核素治療。本研究結(jié)果也顯示，注射錫膠體48 h后仍大量放射性膠體均勻分布在小鼠腹腔內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)腹腔外漏出，而且生存時間分析結(jié)果也證明，實驗組的三組小鼠生存時間與對照組相比，明顯延長其生存時間，尤其是注射18.5 MBq的實驗組生存時間最長（P＜0.001）。細胞凋亡相關蛋白Bax分析結(jié)果顯示，隨著放射性膠體劑量的增加Bax蛋白表達也相應增高，說明輻射生物效應主要決定其療效。正常小鼠腹腔內(nèi)注入膠體37 MBq后第28天一只小鼠死亡，而且注入放射性膠體的小鼠體重與正常對照組相比，隨著放射性劑量的增加開始下降越明顯，隨后體重逐漸增加各組間未見明顯差異，考慮可能與放射毒性及輻射生物效應有關，這些變化與腹腔臟器的組織病理學結(jié)果相符。小鼠腹腔內(nèi)或各臟器的輻射劑量的檢測，其方法比較復雜以及實驗動物等條件限制，本研究未能檢測吸收劑量等指標，是本研究的不足之處，需要進一步探討。

總之，188Re標記的放射性錫膠體不僅物理性能好，取材和制備容易，而且療效佳，副反應小，可以為惡性胸、腹水的治療提供了更多的選擇。同時本研究在核素和膠體的選擇以及決定劑量等方面進行了對比分析，為臨床進一步推廣提供理論依據(jù)。

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The Therapeutic Effect of 188Re-tin colloid（TC） on the Treatment of Malignant Ascites Model Mice

J IN Yong-nan，DOU Yu，NIE J un-jie，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（24）：024-027

Malignant ascites； 188Re-tin colloid； Animal model

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.24.008

2014-05-26） （本文編輯：歐麗）

①吉林省吉林市人民醫(yī)院 吉林 吉林 132001

②一汽總醫(yī)院

許秉全

【Abstract】 Objective：To investigate and evaluate the therapeutic effect of 188Re-tin colloid （TC） in animal models with malignant ascites.Method：188Re-TC colloid was prepared according to kit instruction，and labeling efficiency was determined by chromatography using radioactive thin-layer scanner.The animal models with malignant ascites were established through injecting 5×106/0.3 mL sarcoma180 cells，cultured in vitro，into abdominal cavity of ICR mice.The experimental animal models were divided into 3 different dose-groups after 3 day of culture，that were 37，18.5 and 9.25 MBq/mL of 188Re-TC respectively.The control groups were also divided into 3 groups，12 mice in each group，which included （1）the mice of malignant ascites by intraperitoneal injection of saline；（2）the normal ICR mice by intraperitoneal injection of 1 mCi/mL 188Re-TC；（3）the normal ICR mice without any treatment.Different collection times of intraperitoneal radioactive distribution images in mice were captured by gamma camera at 3，24 h and 48 h post injection.Then peritoneal effusion was collected to detect the expression of Bax protein by western blotting method，while the major abdominal organs were also collected to evaluate histopathological changes.After injection of 188Re-TC，the body weight and survival time of mice were monitored every two days and observed 80 days in all. Statistical analysis was performed with SPSS （version 10.7）.Survival analysis was calculated by Kaplan Meir statistical methods，difference among groups was compared by log Rank method.Result：Labeling efficiency of the 188Re-TC was higher than 99%.Homogeneous distribution of radioactivity in the abdomen was found in 3，24 and 48 h images of treated mice without abdominal intraperitoneal leakage.Dose-dependent expression of Bax protein was confirmed.Histopathological analysis showed that mice treated with 188Re-TC，compared to the ones treated with saline，expressed more in the liver cell degeneration，spleen white pulp atrophy，neutrophil infiltration，intestinal cell adhension，degradation of gastric glands，and so on.Two groups of mice injected with 1 mCi/mL 188Re-TC showed a trend to loss body weight at the beginning，compared with the other groups，but then the body weight of them gradually increased after 8-10 days，and there was no significant difference between groups（P＞0.05）.Survival analysis results in 80 days after 188Re-TC injection showed that the survival time of 37，18.5 and 9.25 MBq/mL group were （59.0±8.5）d，（63.6±7.1）d and （54.8±7.0）d respectively，and were significantly increased compared with the saline group [（20.0±1.9）d]（P＜0.001）.Conclusion：188Re-TC not only has the better physical properties，but also holds the good curative effects on malignant ascites with less side-effects，which may provide more choice for malignant pleural effusion and ascites.

First-author’s address：The People’s Hospital of J ilin City，J ilin 132001，China