黃朝平 張建輝 朱力 唐嗣泉

·臨床研究·

緊密連接蛋白Claudin-1與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機(jī)制相關(guān)性初探

黃朝平 張建輝 朱力 唐嗣泉

目的 研究緊密連接蛋白Claudin-1在變應(yīng)性鼻炎(AR)患者鼻黏膜中的表達(dá)，初步探討Claudin-1在AR發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 選取AR患者32例作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)以22例單純鼻中隔偏曲患者作為對照組。取患者下鼻甲黏膜，行蘇木素-伊紅(HE)染色，檢測鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)浸潤數(shù)量；采用免疫組織化學(xué)法檢測Claudin-1的表達(dá)，比較2組間Claudin-1的表達(dá)強(qiáng)度；對2組病例中黏膜Eos數(shù)量與鼻黏膜Claudin-1的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組鼻黏膜Eos計(jì)數(shù)(11.52±3.60)顯著高于對照組(1.68±1.36)，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Claudin-1在下鼻甲黏膜的陽性表達(dá)物質(zhì)呈棕黃色、細(xì)顆粒狀，定位于黏膜、腺體上皮的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。實(shí)驗(yàn)組鼻黏膜中Claudin-1的陽性率(25.00%)較對照組低(81.82%)，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Claudin-1的表達(dá)強(qiáng)度與鼻黏膜Eos數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.865，P<0.05)。結(jié)論 Claudin-1在AR患者鼻黏膜中的陽性表達(dá)率明顯下降，提示其表達(dá)下降在AR的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要的作用。(中國眼耳鼻喉科雜志，2014，14：283-286)

變應(yīng)性鼻炎； 鼻黏膜； Claudin-1； 嗜酸性粒細(xì)胞； 免疫組織化學(xué)

黃朝平、張建輝為共同第一作者

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)發(fā)病率高達(dá)10%～25%[1]，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚不完全清楚。鼻黏膜緊密連接(tight junction，TJ)蛋白是其功能的主要承擔(dān)者。TJ蛋白Claudin-1在腫瘤、急性損傷等方面的研究已有報(bào)道，但其與AR發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性研究較少。因此我們以AR患者為研究對象，檢測Claudin-1在AR鼻黏膜上皮的表達(dá)情況，并分析Claudin-1的表達(dá)強(qiáng)度與鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophile, Eos)計(jì)數(shù)的相關(guān)性，初步探討Claudin-1在AR發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料 所有病例及標(biāo)本來源于本科2010年5月～2012年12月期間接受鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療的住院患者，其中32例AR患者作為實(shí)驗(yàn)組、22例單純鼻中隔偏曲患者作為對照組。AR患者入選標(biāo)準(zhǔn)：①診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[2]；②標(biāo)本采集對象為AR合并鼻中隔偏曲行鼻內(nèi)鏡下鼻中隔矯正術(shù)的患者，取其下鼻甲黏膜作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本；③手術(shù)前2周停止全身和鼻腔局部用糖皮質(zhì)激素及抗組胺等抗過敏藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前6個月內(nèi)曾經(jīng)接受免疫治療者；②孕婦或哺乳期婦女；③合并阿司匹林三聯(lián)征、嚴(yán)重的全身性疾病、免疫功能缺陷、自身免疫性疾病或者其他可能影響結(jié)果判斷的患者；④年齡>70歲或<14歲,無法配合完成問卷調(diào)查者。符合標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)組患者中，男性18例、女性14例；年齡16～58歲，平均35.3歲；病程1～23年，平均6.2年。具有鼻癢、連續(xù)性打噴嚏、流大量清涕、鼻塞、鼻黏膜水腫等典型癥狀和體征。變應(yīng)原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陽性，主要以塵螨、屋塵螨為主。對照組為單純鼻中隔偏曲患者，其中男性12例、女性10例；年齡19～54歲，平均32.4歲。全部切取代償性肥大的一側(cè)下鼻甲黏膜作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。本課題經(jīng)本院倫理委員會審定同意，所有患者在術(shù)前簽署了研究知情同意書。

試劑：兔抗人Claudin-1多克隆抗體(一抗)，山羊抗兔IgG(二抗)，辣根過氧化物酶結(jié)合物，二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒，均購自上海生物工程股份有限公司。

1.2 方法 所有新鮮下鼻甲黏膜標(biāo)本用4%中性甲醛固定，石蠟包埋，垂直黏膜上皮切成4 μm厚的連續(xù)切片，每組標(biāo)本均行常規(guī)蘇木素-伊紅(haematoxytin-eosin, HE)染色，同時(shí)按照免疫組織化學(xué)說明書進(jìn)行。抗原修復(fù)采用高壓加熱法，均設(shè)陰性對照。

HE染色于高倍鏡(×400)下計(jì)數(shù)5個視野Eos后取平均值[3]。Clandin-1的陽性表達(dá)以鼻黏膜及腺體上皮的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色、細(xì)顆粒狀為判定標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)的染色程度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行分析評分:基本不著色為0分；著色淡為1分；著色適中為2分；著色深為3分。另外，每張切片400倍視野下隨機(jī)選擇不重復(fù)的5個視野，每個視野計(jì)數(shù)100個上皮細(xì)胞，計(jì)算其中著色細(xì)胞的百分率。著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。將每張切片細(xì)胞著色程度得分與著色細(xì)胞百分率得分各自相乘，總分0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，6分以上為強(qiáng)陽性(+++)。+為低表達(dá)即陰性表達(dá)，++與+++為高表達(dá)，即陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組所得結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0軟件對免疫組織化學(xué)結(jié)果作χ2檢驗(yàn)，均取檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P=0.05，兩因素間的相關(guān)性采用直線線性相關(guān)分析，當(dāng)P<0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 AR患者鼻黏膜組織水腫，上皮部分脫落，伴杯狀細(xì)胞增生，固有層血管擴(kuò)張充血，可見散在紅細(xì)胞，腺體增生，組織間可見較多炎性細(xì)胞(包括Eos、淋巴細(xì)胞等)浸潤，其中以Eos為甚(圖1)。對照組鼻黏膜上皮相對完整，腺體無明顯增生。高倍鏡(×400)下計(jì)數(shù)Eos，AR組Eos浸潤明顯(11.52±3.60)，顯著高于對照組(1.68±1.36)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 免疫組織化學(xué) Claudin-1在AR患者及鼻中隔偏曲患者下鼻甲黏膜中陽性表達(dá)(呈棕黃色、細(xì)顆粒狀)于黏膜上皮、腺體上皮的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。AR患者下鼻甲黏膜上皮、腺體細(xì)胞可見少量或者無Claudin-1表達(dá)(圖2)，而對照組下鼻甲黏膜中Claudin-1陽性表達(dá)強(qiáng)度明顯增高(圖3)，2組的陰性對照組均未見棕黃色，呈陰性表達(dá)(圖4)。AR組及對照組下鼻甲黏膜中Claudin-1表達(dá)差異比較(表1)，結(jié)果表明Claudin-1在AR患者下鼻甲黏膜中的陽性表達(dá)率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1. AR下鼻甲黏膜 HE×200

圖2. AR組下鼻甲黏膜 Claudin-1 ×200

圖3. 對照組下鼻甲黏膜 Claudin-1 ×200

圖4. 對照組 Claudin-1 ×200

組別 nClaudin?1陽性Claudin?1陰性Claudin?1陽性率(%)實(shí)驗(yàn)組3282425．00a對照組2218481．82合計(jì)54262848．15

注：a示與對照組比較，2組Claudin-1表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.86，P<0.05)

2.3 相關(guān)性分析 將Claudin-1的表達(dá)強(qiáng)度與鼻黏膜Eos計(jì)數(shù)進(jìn)行直線線性相關(guān)檢驗(yàn)，提示Claudin-1的表達(dá)量與鼻黏膜Eos含量成負(fù)相關(guān)(r=-0.865，P<0.05)。

3 討論

目前關(guān)于AR發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)成為國際上鼻科學(xué)的熱點(diǎn)，研究的方向呈現(xiàn)“百花齊放”之態(tài)勢。歸納起來，主要集中在以下方面：細(xì)胞因子的改變[4]；Th1/Th2細(xì)胞比例失衡[5]；炎性細(xì)胞的浸潤[6]；衛(wèi)生學(xué)說的進(jìn)一步研究[7-8]；以及遺傳即相關(guān)基因的研究[9]等，而對于鼻黏膜上皮細(xì)胞(nasal epithelial cells，NECs)在AR發(fā)病機(jī)制中所扮演的重要角色卻研究較少。由于NECs的完整性對于特異性抗原的進(jìn)入具有決定性作用，因此，觀察NECs在AR發(fā)病時(shí)的形態(tài)及其成分的改變有助于從源頭認(rèn)識AR的發(fā)病機(jī)制，從而有望從另外一個角度提出AR的治療思路。

NECs作為機(jī)體的第一道屏障及固有免疫系統(tǒng)，其主要功能為阻止異物、外界微生物及各種變應(yīng)原進(jìn)入到黏膜下層。Sakakura等[10]已經(jīng)研究證明了正常情況下一般的抗原物質(zhì)如粉塵螨Ⅰ類抗原(Der p1)等是通過細(xì)胞間隙穿過黏膜上皮的。我們推測，如果Der p1等變應(yīng)原物質(zhì)對細(xì)胞間質(zhì)蛋白(即TJ蛋白)有直接的水解作用,那么TJ蛋白在NECs的含量或者分布就可能存在變化。當(dāng)AR發(fā)病時(shí)，NECs的TJ蛋白可能出現(xiàn)斷裂，由此TJ蛋白(包括Claudin、Occludin及ZO-1、ZO-2等)的表達(dá)可能出現(xiàn)下調(diào)。

鼻黏膜上皮間的TJ蛋白對其功能的維持有重要作用。TJ蛋白存在于上皮細(xì)胞間，長度50～400 nm。由于它的存在，相鄰細(xì)胞之間的質(zhì)膜緊密結(jié)合，沒有縫隙，甚至連水分子都不能透過。Furuse等[11]最早發(fā)現(xiàn)Claudin家族，目前已發(fā)現(xiàn)24種Claudin家族成員，它們具有相似的結(jié)構(gòu)。Claudin家族中各成員間細(xì)胞外大環(huán)上的氨基酸位置和所帶電荷都有很大差異，由此成為區(qū)分它們的標(biāo)志之一[12]，其對于細(xì)胞間的滲透性以及緊密連接帶的形成具有重要的作用。而位于細(xì)胞內(nèi)部的C末端長度是固定的，但其序列的不同是區(qū)分Claudin各成員的另外一個特征。目前已公認(rèn)，Claudin家族是TJ蛋白中最為重要的一組蛋白,其對維持緊密連接的滲透性起著至關(guān)重要的作用[13]，而其中又以Claudin-1研究較多，作用相對更重要，因此我們選擇Claudin-1作為觀察指標(biāo)。

有學(xué)者[14]通過對下呼吸道的研究表明，呼吸道上皮細(xì)胞脫落可能使得黏膜內(nèi)感覺神經(jīng)暴露，從而導(dǎo)致黏膜處于高敏狀態(tài)，這從另外一個角度說明了呼吸道黏膜上皮的完整性對于其功能的發(fā)揮具有重要意義。Runswick等[15]在研究AR時(shí)證實(shí)，花粉蛋白酶直接或者間接地破壞鼻黏膜上皮TJ蛋白，而這被認(rèn)為可能是促進(jìn)變應(yīng)原進(jìn)入上皮的機(jī)制。Vinhas等[16]進(jìn)行類似研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，花粉含有高相對分子質(zhì)量的蛋白酶，它們通過破壞Occludin、Claudin-1 和E-黏附分子而增加了Claudin-3跨上皮滲透的能力。這些研究都表明鼻黏膜上皮TJ蛋白的破壞可能是AR發(fā)病的第一步。

本研究采用AR患者作為實(shí)驗(yàn)組，單純鼻中隔偏曲患者作為對照組，取其下鼻甲黏膜組織進(jìn)行研究，首先對2組鼻黏膜組織Eos計(jì)數(shù)顯示，AR組下鼻甲黏膜可見大量Eos浸潤，而對照組僅見少量炎性細(xì)胞，幾乎無Eos。這個結(jié)論與之前其他學(xué)者[3]的研究基本一致。

我們以免疫組織化學(xué)的方法分別觀察了AR及單純鼻中隔偏曲患者下鼻甲黏膜中Claudin-1蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：Claudin-1在兩者下鼻甲黏膜中陽性表達(dá)于黏膜上皮、腺體上皮的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色、細(xì)顆粒狀。AR患者鼻黏膜中Claudin-1陽性表達(dá)率明顯較低，而對照組中鼻黏膜中Claudin-1陽性表達(dá)率明顯偏高，2組間的Claudin-1陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示鼻黏膜上皮TJ蛋白Claudin-1的破壞缺失可能對AR的發(fā)病起較為關(guān)鍵的作用。將Claudin-1在鼻黏膜的表達(dá)水平與鼻黏膜HE染色Eos計(jì)數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示鼻黏膜Claudin-1的表達(dá)水平與鼻黏膜Eos計(jì)數(shù)存在顯著負(fù)相關(guān)。我們推測，外界變應(yīng)原通過酶解鼻黏膜上皮TJ蛋白，造成細(xì)胞間隙過大，變應(yīng)原進(jìn)入黏膜下層，引發(fā)變態(tài)反應(yīng)，導(dǎo)致鼻黏膜Eos活化和浸潤，并造成Th1/Th2細(xì)胞失衡，引起Th2細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素4(interleukin-4, IL-4)、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子，而這些細(xì)胞因子又刺激Eos的發(fā)育、活化及浸潤，由此形成惡性循環(huán)，引發(fā)鼻癢、連續(xù)性打噴嚏、流清涕等臨床癥狀。

關(guān)于上皮細(xì)胞損傷是組織重塑的重要表現(xiàn)之一，目前已無異議，而AR鼻黏膜組織重塑的主要表現(xiàn)為黏膜纖毛上皮損傷、杯狀細(xì)胞增生等[17]，通過HE染色發(fā)現(xiàn)，AR患者鼻黏膜普遍存在上皮脫落、腺體增生等病理表現(xiàn)。在我們研究的AR組中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)鼻黏膜上皮脫落和Claudin-1表達(dá)下降的現(xiàn)象，與之前的研究結(jié)果基本一致。

TJ蛋白Claudin-1在AR患者鼻黏膜中表達(dá)降低，并可能促進(jìn)Eos的活化、浸潤，Claudin-1在鼻黏膜上皮中表達(dá)下降可能在AR發(fā)病過程中發(fā)揮較為重要的作用，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

[ 1 ] Bousquet J，Khahaev N，Cruz AA, et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma(ARIA)2008 update(in collaboration with the World Health Organization，GA2LEN and AllerGen)[J].Allergy,2008,63(Suppl86):8-160.

[ 2 ] 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編委會鼻科組，中華醫(yī)學(xué)會耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)分會鼻科學(xué)組.變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2009年，武夷山)[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2009,4(12):977-978.

[ 3 ] 王長青,趙長青,索利敏.冷束縛應(yīng)激對變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜中嗜酸粒細(xì)胞及白細(xì)胞介素2和6表達(dá)的影響[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2009,44(12):986-990.

[ 4 ] 謝志海,趙素萍,王承龍,等. 神經(jīng)生長因子mRNA在變應(yīng)性鼻炎病人鼻黏膜中的表達(dá) [J]. 中國耳鼻咽喉顱底外科雜志,2005,11(6):203-209.

[ 5 ] Bach JF.The effect of infectious on susceptibility to autoimmune and allergic diseases[J].N Engl J Med, 2002,347(12): 911-920.

[ 6 ] 陳金湘,楊瑞嘉,黃志純.變應(yīng)性鼻炎神經(jīng)肽與肥大細(xì)胞關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,21(20):115-116.

[ 7 ] Strechan DP. Hay fever, hygiene,and household size[J]. BMJ, 1989, 299(6710): 1259-1260.

[ 8 ] Straehan DP.Family?size,infection and atopy:the first decade of the “hygiene hypothesis”[J].Thorax,2000,55(Suppl 1):2-10.

[ 9 ] Haagerup A, Bjerke T, Schoitz PO, et al.Allergic rhinitis:a total genome-scan for susceptibility genes suggests a locus on chromosome 4q24-q27[J].Eur J Hum Genet,2001,9(12): 945-952.

[10] Sakakura Y, Majima Y, Mitsui H, et al. Absorption of various drugs through the rabbit′s respiratory mucosainvitro[J].Arch Otorhinolaryngol, 1983,238(1):87-96.

[11] Furuse M, Fujita K, Hiiragi T, et al.Claudin-1 and -2:novel integral membrance proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin[J].J Cell Biol,1998,141(7):1539-1550.

[12] Rüffer C, Gerke V. The C-terminal cytoplasmic tail of ciaudins 1 and 5 but not its PDZ-binding motif is required for apical localization at epithelial and endothelial tight junctions[J]. Eur J Cell Biol, 2004, 83(4): 135-144.

[13] Turksen K, Troy TC. Barriers built on claudins[J].J Cell Sci,2004,117(12):2435-2447.

[14] Jeffery PK, Wardlaw AJ, Nelson FC, et al. Bronchial biopsies in asthma.An ultrastructural,quantitative study and correlation with hyperreactivity[J].Am Rev Respir Dis,1989,140(6): 1745-1753.

[15] Runswick S，Mitchell T, Davies P, et al.Pollen proteolytic enzymes degrade tight junctions[J]. Respirology,2007,12(6):834-842.

[16] Vinhas R, Cortes L, Cardoso I,et al. Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides[J]. Allergy, 2011, 66(8): 1088-1098.

[17] 韓德明.變應(yīng)性鼻炎[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:13-16.

(本文編輯 楊美琴)

Correlation of Claudin-1 and nosogenesis in allergic rhinitis

HUANGChao-ping,ZHANGJian-hui,ZHULi,TANGSi-quan.

DepartmentofOtorhinolaryngologyHeadandNeckSurgery,theAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China

Corresponding author： ZHU Li，Email：1968403299@qq.com

Objective To investigate the expression of Claudin-1 in allergic rhinitis(AR) and the role of Claudin-1 in the pathogenesis of AR. Methods Thirty-two AR patients were recruited as the experimental group and 22 cases with deflection of nasal septum (DNS) as the control group. Specimens of inferior turbinate were fixed by 4% formaldehyde. The number of eosinophils(Eos) was measured by haematoxylin-eosin staining. The expression of Claudin-1 was detected by immunohistochemical staining. The results were compared between the two groups. Correlation of Eos content and the expression intensity of Claudin-1 in nasal mucosa was analyzed. Results Eos counts of the specimens in AR group(11.52±3.60) were higher than those in the control group(1.68±1.36) (P<0.05). The positive findings of Claudin-1 by immunohistochemical analysis in the two groups were found in the cytoplasm of the mucosal epithelial cells and glandular cells(brownish yellow,fine granular). The positive rate of Claudin-1 in AR group(25.00%) was significantly lower than that in the DNS group (81.82%) (P<0.05). There was negative correlation between the positive rate of Claudin-1 and the Eos count in nasal mucosa(r=-0.865，P<0.05). Conclusions The tight junction protein Claudin-1 was expressed in the cytoplasm of the mucosal epithelial cells and glandular cells. The down-regulation of Claudin-1 in nasal muscosa imply that it may play an important role in the pathogenesis of AR. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2014,14:283-286)

Allergic rhinitis; Nasal mucosa; Claudin-1; Eosinophils; Immunohistochemistry

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 南充 637000

朱力(Email：1968403299@qq.com)

現(xiàn)工作單位：成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科 成都 610599

2013-09-16)