郭捷 花錦 王蓉珍 田海嬌

1（山西省分析科學(xué)研究院，山西太原030006）

2（山西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山西太原030024）

·食品分析·

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定獸藥中3種違禁雌激素

郭捷1*花錦2王蓉珍1田海嬌1

1（山西省分析科學(xué)研究院，山西太原030006）

2（山西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山西太原030024）

建立了飼料級獸藥制劑中違禁藥物己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。用無水乙醇超聲提取試樣中3種雌激素，以乙腈-水作流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧電離方式（ESI-），通過多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）定量。該方法靈敏度高，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99，回收率在70.9%～98.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于8.3%。本方法快速、簡便、精確度高、準(zhǔn)確度高，適用于獸藥制劑中己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚違法添加的定性、定量分析。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；獸藥制劑；雌激素；違禁藥物

雌激素作為內(nèi)分泌干擾物之一，有研究表明兒童性早熟、男性前列腺癌、婦女乳腺癌和子宮癌發(fā)病率的上升與食品中雌激素的殘留有關(guān)。我國農(nóng)業(yè)部第193號公告里禁止性激素和具有雌激素樣作用的物質(zhì)在食品動物中的使用。己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚為雌激素，很多養(yǎng)殖戶對其毒副作用了解不足，常在動物飼養(yǎng)中用作生長素且用藥劑量偏高，常造成中毒。因此，為保障食品的安全，內(nèi)源性和外源性雌激素同時檢測就顯得尤為重要。

目前獸藥制劑中己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚的常用檢測方法是氣相質(zhì)譜色譜法（GC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）以及熒光光度法（FS）和毛細(xì)管電泳法（CAE）等。而對超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLC-MS/MS）的報(bào)道甚少，但其具有靈敏度更高、進(jìn)樣更快速、更高效等優(yōu)勢。本文以現(xiàn)有的文獻(xiàn)為基礎(chǔ)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對獸藥制劑中3種雌激素添加量進(jìn)行檢測分析，該方法檢測靈敏度高、專屬性強(qiáng)，對保障獸藥安全具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀，美國Waters公司；TQD串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，美國Waters公司；TALBOYS渦旋混合器；Ultra turrax IKA T18超聲波。

乙腈、甲醇，色譜純，美國Fisher公司；無水乙醇，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水均為蒸餾水。

己烯雌酚，純度98.00%；雙烯雌酚，純度100%；己烷雌酚，純度99.80%，國家生物制品所提供。準(zhǔn)確稱取的己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，用甲醇分別溶解并準(zhǔn)確定容到10 mL，制備成質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，該溶液可在0℃～4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

本試驗(yàn)通過參考文獻(xiàn)對多種提取方法進(jìn)行對比后，采用超聲萃取法，簡單高效。取1.0 g樣品，加入2 mL無水乙醇溶液，后超聲10 min，將樣液過孔徑0.22 μm濾膜至進(jìn)樣瓶，進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：BEHC18柱（50mm×2.1mm，1.8μm）；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：乙腈和水，梯度洗脫程序見表1。

1.2.3 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧電離（ESI-）；掃描方式：負(fù)離子掃描；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：380℃；錐孔氣流：氮?dú)猓魉?0 L/h；去溶劑氣流：氮?dú)?，流?00 L/h；碰撞氣：氬氣；碰撞氣壓：3.50×10-4Mpa；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），多反應(yīng)監(jiān)測條件見表2。

以現(xiàn)場油井5個月的實(shí)際日產(chǎn)油量為依據(jù)，對樁59-X30井的生產(chǎn)情況進(jìn)行歷史擬合，通過調(diào)節(jié)相滲曲線，擬合產(chǎn)油量與實(shí)際日產(chǎn)油量。

表1 梯度洗脫程序

表2 離子對、錐孔電壓、碰撞能量

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 方法的線性范圍

準(zhǔn)確移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。根據(jù)樣液中3種雌激素的含量情況，選定峰高相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。用甲醇將3種雌激素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度（0.00 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.50 mg/L）進(jìn)行測定，以峰面積（Y軸）對相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X軸）作圖，結(jié)果表明己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚溶液質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.997 3。以信噪比（S/N）≥10計(jì)算，飼料及獸藥中己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的測定低限均為0.2 mg/kg。

2.2 方法的回收率與精密度

按照SN/T 0001標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，禁用物質(zhì)或未設(shè)定容許限的物質(zhì)，一般選擇LOQ、2LOQ、10LOQ作為添加濃度水平進(jìn)行回收率試驗(yàn)，本方法檢測樣品中3種雌激素的含量較低，故采用不含以上3種雌激素的的空白樣品基質(zhì)進(jìn)行3個濃度水平（0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg）的添加回收試驗(yàn)，測得3種物質(zhì)的回收率范圍在70.9%～98.8%之間，RSD范圍均在8.3%以下。

表3 LC/MS/MS法檢測己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚的回收率和精密度

2.3 結(jié)果計(jì)算

采用外標(biāo)法定量，按下式計(jì)算樣品中3種雌激素的含量，計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。

式中：Xi──試樣中雌激素含量，mg/kg；

Ci──試液中雌激素質(zhì)量濃度，μg/L；

V──試樣溶液定容體積，mL；

m──試樣溶液所代表試樣的質(zhì)量，g；

R──回收率，%。

3 討論

3.1 流動相的優(yōu)化

流動相的組成是影響待測物質(zhì)分離效果和保留時間的重要因素，試驗(yàn)考察了甲醇-水和乙腈-水2種流動相對3種激素的分離效果，結(jié)果表明，以甲醇-水作流動相時，3種雌激素分離的峰型不理想，己烯雌酚的峰形出現(xiàn)拖尾；以乙腈-水作流動相效果較好。

3.2 儀器條件的優(yōu)化

采用自動進(jìn)樣，在負(fù)離子模式下進(jìn)行條件優(yōu)化；選擇己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚的最佳分子離子峰及其錐孔電壓，然后再對進(jìn)行一對碎片選擇及碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化；在此優(yōu)化條件下，3種雌激素的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖分別見圖1，圖2，圖3。

圖1 己烯雌酚（0.1 mg/kg）多反應(yīng)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

圖2 雙烯雌酚（0.1 mg/kg）多反應(yīng)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

圖3 己烷雌酚（0.1 mg/kg）多反應(yīng)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

3.3 不同獸藥制劑中3種雌激素非法添加的檢測

按照建立的方法對市面上收集的15批獸藥制劑喹氟寧、替米考星溶液、氟苯尼考粉、桿痢清、霉毒凈、護(hù)肝顆粒、蒙脫石粉、藍(lán)天酵素菌、呼支暢、桉薄溶液、硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（泌乳期）、注射用黃連、防己合劑、鹽酸沃尼妙林、鹽酸沃尼妙林預(yù)混劑10%進(jìn)行己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚非法添加的普查，15份獸藥制劑均未檢出3種雌激素添加。

4 結(jié)論

文中建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜-電噴霧負(fù)離子測定飼料級獸藥制劑中非法添加物己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚的檢測方法，該法快速、簡單、有效、回收率高，可很大程度上降低日常檢測過程中的檢測成本，縮短檢測周期，為檢測獸藥制劑中非法添加己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚提供了有效的前處理方法和檢測手段。

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Determination of three prohibited estrogens in feed grade veterinary preparations by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

GUO Jie1*HUA Jin2WANG Rong-zhen1TIAN Hai-jiao1

1（Shanxi academy of analytical sciences，Shanxi Taiyuan030006，China）

2（Shanxi entry-exit inspection and quarantine bureau，Shanxi Taiyuan030024，China）

A method of determination of illegal drugs diethylstilbestrol,dienestrol，and hexoestrolin feed grade veterinary preparations by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS)was developed.Three kinds of estrogens in samples were extracted by ultrasound with ethanol.A gradient system of acetonitrile and water with multi-reaction monitoring（MRM）was employed for quantitative determination.This method has high sensitivity and good linear relationship，the correlation rate was 0.99.The average recoveries ranged from70.9%to98.8% with relative standard deviation less than 8.3%.The determination method was characterized by simplicity,higher sensitivity,and accuracy.It is suitable for qualitative and quantitative analysis of illegal drugs diethylstilbestrol,dienestrol and hexoestrolin feed grade veterinary preparation.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；veterinary preparations；estrogens；illegal drugs

TS202.3

A

1673-6044（2014）04-0048-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.04.015

*郭捷，女，1963年出生，1985年畢業(yè)于山西大學(xué)分析化學(xué)專業(yè)，高級工程師。

2014-12-01