周曼，楊萬超，劉翔，于淼綜述 李文志審校

綜述

血腦屏障結(jié)構(gòu)功能及體外模型的研究進展

周曼，楊萬超，劉翔，于淼綜述 李文志審校

血腦屏障；腦微血管內(nèi)皮細胞；星形膠質(zhì)細胞；周細胞

血管與腦、脊髓細胞外液之間存在的一個調(diào)節(jié)界面，即腦屏障。由血腦屏障(BBB)、血—腦脊液屏障(BCSFB)和腦脊液—腦屏障共同組成。腦屏障僅允許必需的代謝物質(zhì)進入，阻止和移除不需要的代謝產(chǎn)物或毒性物質(zhì)[1]，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)能夠在腦外環(huán)境不斷動態(tài)變化的情況下，保持神經(jīng)組織的正?；顒蛹皟?nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[2]。3個屏障中，BBB最為重要。BBB是血液和CNS之間物質(zhì)交換的基礎(chǔ)并具有精密的解剖結(jié)構(gòu)，其完整性無論是在生理還是病理情況下都是極其重要的。BBB具有諸多重要作用，包括為腦部必需營養(yǎng)物質(zhì)提供運輸通道，調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的流出，限制離子和液體在血液與腦之間的運輸?shù)取Ｄ壳皩BB的研究已成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點，此類研究中的絕大部分均是借助BBB體外模型來完成的。本文將從BBB的結(jié)構(gòu)、功能及體外模型的建立三個方面介紹BBB對CNS乃至整個機體的作用。

1 BBB的結(jié)構(gòu)

BBB由復(fù)雜的多種細胞構(gòu)成，其功能依靠各種細胞間的相互作用共同完成。BBB的基本結(jié)構(gòu)包括腦微血管內(nèi)皮細胞(BMEC)及其間的緊密連接(tight junctions, TJ)、基底膜和星形膠質(zhì)細胞終足、周細胞和狹小的細胞外隙[2]?；啄ぁ⑿∧z質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、BMEC以及神經(jīng)元共同組成神經(jīng)血管單元(neurovascular unit,NVU)。NVU對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和生理功能的維持是至關(guān)重要的。

1.1 BMEC 不同于其他血管床上的內(nèi)皮細胞，BMEC具有其獨特的特點：內(nèi)皮細胞薄，無窗孔，細胞之間存在緊密連接，很大程度限制了蛋白及離子的通過；內(nèi)皮細胞帶負電，故導(dǎo)致帶負電的物質(zhì)不易進入腦組織；BMEC線粒體的含量為其他組織內(nèi)皮細胞含量的3倍，因此其代謝活躍，能夠為腦細胞提供主動轉(zhuǎn)運物質(zhì)的能量。

1.2 TJ TJ通過嚴格限制BMEC及外周血之間物質(zhì)的流動性以維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性[3]。TJ具有精細的結(jié)構(gòu)，其通過延長上皮與BMEC間隙間的頂端區(qū)域發(fā)揮以下兩方面的作用：一方面作為一種“拉鏈”結(jié)構(gòu)有效地分開細胞膜的頂部和底部，從而造成細胞膜上成分的不均勻分布；另一方面作為一種“柵欄”結(jié)構(gòu)限制細胞間的通透性。緊密連接對細胞間的信號傳導(dǎo)反應(yīng)十分迅速并且具有高度動態(tài)的結(jié)構(gòu)，可以迅速改變表達方式、亞細胞定位、翻譯后修飾，從而影響蛋白與蛋白間的相互作用。緊密連接蛋白在維持BMEC之間相互作用的穩(wěn)定性方面所起到的作用越來越受到關(guān)注[4]。

1.3 基底膜 基底膜是特異的細胞外基質(zhì)?；啄さ纳飳W(xué)活性對內(nèi)皮細胞的生長發(fā)育、分化和功能維持都有重要影響?；啄さ闹饕Y(jié)構(gòu)成分包括IV型膠原蛋白、與膠原蛋白連接的層粘連蛋白(laminin, LN)和纖維連接蛋白(fibronectins, FN)、巢蛋白(nidogen-1)以及蛋白多糖等?；啄ぞ哂卸ㄎ患毎蜑槟X部固有細胞之間提供聯(lián)系的作用。星形膠質(zhì)細胞、周細胞及BMEC都是基底膜的組成部分[5]。BMEC外面的基底膜較其他部位的基膜厚，為血管基膜與神經(jīng)上皮基膜的融合?；啄さ钠茐膶绊態(tài)MEC上緊密連接蛋白的表達并且在許多病理情況下會增加BBB的通透性[6]。

1.4 星形膠質(zhì)細胞 星形膠質(zhì)細胞可以誘導(dǎo)BMEC發(fā)揮有效的屏障功能。腦毛細血管壁上有星形膠質(zhì)細胞深處的腳板黏附，形成膠質(zhì)膜，包繞毛細血管基膜的85%，能夠阻擋部分大分子物質(zhì)通過，同時還有主動運輸某些物質(zhì)的功能。另外，星形膠質(zhì)細胞是許多調(diào)節(jié)因子如TGF-β[7]、GDNF、bFGF、IL-6等的重要來源。

1.5 周細胞 周細胞是環(huán)繞緊貼于毛細血管和毛細血管后微靜脈壁外周的一種結(jié)締組織型的細胞，除BMEC外，周細胞是腦微血管另一種重要的壁細胞，與BMEC有共同的基底膜，為腦微血管提供機械支持。周細胞內(nèi)含有收縮性蛋白而被認為與血管收縮有關(guān)[8]，對視網(wǎng)膜的屏障功能及起著重要的作用[9，10]。

2 BBB的功能

BBB是維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的選擇性血管屏障，可動態(tài)反映BMEC的生理活動。相鄰的BMEC間緊密連接的存在構(gòu)成了BBB的一層物理屏障，阻止細胞間的分子通過BBB。通過位于內(nèi)皮細胞膜內(nèi)外的特殊轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，BBB允許和促進所需的營養(yǎng)物質(zhì)通過，并且排除和阻止有潛在危害性的物質(zhì)通過，因此BBB也可以作為一個選擇性的轉(zhuǎn)運屏障。BBB同時可作為一道代謝屏障[5]，屏障上細胞內(nèi)和細胞外的酶類(乙酰膽堿酯酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、單胺氧化酶)具有滅活神經(jīng)刺激性及毒性物質(zhì)且可以促進肽類及ATP代謝的作用。以上任何功能的失調(diào)都將會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性下降及功能障礙[11]。BBB功能的變化與許多病理過程密切相關(guān)，如屏障功能的破壞會引發(fā)諸多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括感染和炎性反應(yīng)[12]、休克、多發(fā)性硬化癥[13]、阿爾茲海默病[14]、帕金森病、腦水腫、青光眼[15]等。BBB的功能障礙可能與屏障慢性損壞所致的緊密連接功能的破壞及暫時性開放有關(guān)。這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生是否由于BBB的損壞所致目前仍不明確，但可以證實的是屏障損壞可以加劇病理過程的進展[16]。

BMEC是構(gòu)成血腦屏障的基礎(chǔ)，在缺氧等病理損害中，內(nèi)皮細胞往往是損害的直接靶細胞，并且缺氧還會引起一系列細胞生長內(nèi)環(huán)境的變化。BMEC以細胞間的TJ為主要特征,細胞外的基底膜是連續(xù)的，胞飲作用很微弱、缺少窗口結(jié)構(gòu)、無Weible-Palade小體。這些是BBB的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，防止大腦被血液內(nèi)的微生物和毒素所傷害[17]。有害物質(zhì)在通過BMEC時會受到胞漿內(nèi)酶系統(tǒng)的作用而破壞，因此即使能夠進入BMEC卻不能通過血腦屏障而進入腦實質(zhì)。

最近有研究證明星形膠質(zhì)細胞在腦缺血缺氧和維持屏障功能方面對BMEC起到輔助作用并促進其發(fā)揮保護作用[18]。有研究證實周細胞可能參與了物質(zhì)通過BBB的過程[19]。在缺血缺氧過程中，星形膠質(zhì)細胞和/或周細胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子、促紅細胞生成素、神經(jīng)膠質(zhì)衍化神經(jīng)營養(yǎng)性因子以及神經(jīng)營養(yǎng)因子等多種因子，反映了損傷調(diào)節(jié)因子的多樣性，并且這些因子可以提高屏障功能及BMEC在損傷過程中的存活率。然而，近期有研究表明由于損傷的程度和持續(xù)時間不同，每種細胞在維持屏障功能方面所起的作用也是不同的[19]。例如在急性缺氧性損傷過程中星形膠質(zhì)細胞對BMEC屏障的保護作用強于周細胞，而在慢性缺氧性損傷過程中周細胞則比星形膠質(zhì)細胞具有更強的保護作用，這可能是由于信號通路的調(diào)節(jié)機制不同以及血管內(nèi)皮細胞因子等的釋放所導(dǎo)致的[19]。

體外模型研究證實周細胞可以提高BBB的功能[20, 21]。周細胞表面有血小板生長因子(PDGF-B)表達，它由BMEC分泌并且對腦血管的形成十分關(guān)鍵，血小板生長因子基因的破壞會導(dǎo)致周細胞的缺失、BMEC增生，并且增加新生兒致死率[22, 23]。在敲除周細胞的大鼠模型中已證實周細胞在功能調(diào)節(jié)方面起到重要的作用，包括TJ的形成，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)皮細胞的囊泡運輸，星形膠質(zhì)細胞的極化以及維持細胞間功能的完整性[24]。此外，在周細胞缺失的大鼠體內(nèi)，年齡依賴性的血管損害要先于神經(jīng)元變性、學(xué)習(xí)及記憶功能病損以及神經(jīng)炎性反應(yīng)的發(fā)生[25]。因此，周細胞調(diào)控的主要神經(jīng)血管功能對BBB及固有神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能的維持是十分必要的。

3 BBB的體外模型

關(guān)于BBB的許多研究都是借助體外模型來實現(xiàn)的，體外BBB模型的建立可滿足許多實驗對血腦屏障進行精細調(diào)節(jié)的要求，不但加深了對BBB物質(zhì)流動調(diào)控過程的了解，還能幫助我們更加透徹地理解屏障功能的調(diào)節(jié)、生理及病理的變化過程。相對于體內(nèi)模型，體外模型具有功能多樣性、相對簡單性、耗資較低等優(yōu)點，因此在近期的研究中被更加被廣泛地應(yīng)用。

3.1 MDCK(Madin-Darby canine kedney)細胞模型 曾有學(xué)者利用非腦部來源的MDCK細胞進行BBB體外模型的研究，MDCK細胞間具有良好的通透性等特點，然而與腦內(nèi)皮細胞之間仍存在許多差異[26]。MDCK中緊密連接蛋白以claudin-1為主，而BMEC中則為claudin-5；在MDCK細胞中表達的ZO-3在BMEC中則沒有表達。許多結(jié)構(gòu)及蛋白表達上的差異導(dǎo)致MDCK細胞所制備的BBB模型在研究過程中與實際BBB對藥物等的通透性及代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程有很大差異，現(xiàn)已很少應(yīng)用。

3.2 HUVECs(Human umbilical endothelial cells)模型 人臍帶血內(nèi)皮細胞在BBB模型制備過程中也被頻繁使用[26]，HUVECs為人體來源的細胞，在BBB研究過程中易于將體外研究成果還原于體內(nèi)，但是由于HUVECs亦不是腦組織來源的細胞，一些緊密連接蛋白、通路、受體與BMEC的表達也不盡相同，因此研究價值低于BMEC模型。

3.3 永生細胞模型 在早期BBB體外模型的構(gòu)建過程中也曾利用永生細胞進行模型制備，此模型不僅可以避免原代細胞提取過程的繁瑣步驟，也排除了其他細胞的污染，有利于細胞的純化[27]，但是永生細胞構(gòu)建的體外模型不能完全體現(xiàn)BBB的特點，并且失去了BBB重要的屏障功能，所以目前很少應(yīng)用。

3.4 BMEC模型 從BMEC單層培養(yǎng)到BMEC與星形膠質(zhì)細胞(T1A)共同培養(yǎng)的二維(2D)模型，再到此2種細胞與周細胞共同培養(yǎng)的三維(3D)立體模型，其造價、性能也大不一樣。目前被應(yīng)用的是2D和3D模型，它們分別有各自的優(yōu)點和缺點。

3.4.1 二維模型(2D)： 20世紀80～90年代，許多學(xué)者開始嘗試將BBB中2種主要細胞(多數(shù)為BMEC與星形膠質(zhì)細胞)進行共同培養(yǎng)，在逐漸摸索中形成了當(dāng)今被廣泛應(yīng)用的BBB 2D模型。2D模型能夠充分體現(xiàn)內(nèi)皮細胞的屏障作用，這種模型可以用于許多方面的研究，包括藥理學(xué)研究[28]，物質(zhì)的轉(zhuǎn)運、遷移以及代謝等研究。模型制備是通過原代培養(yǎng)BMEC和腦星形膠質(zhì)細胞，并借助Trans-well 小室構(gòu)建2種細胞共培養(yǎng)模型，待2種細胞融合80%后，進行屏障功能鑒定后即可作為體外BBB的研究。

3.4.2 三維模型(3D)： BBB上的各種細胞均有自身獨特的空間定位，這是細胞之間進行相互作用以及維持BBB屏障功能的基礎(chǔ)。因此，學(xué)者們基于此制備了BBB的3D模型。3D模型所反映的細胞間的移動以及動態(tài)的相互作用與體內(nèi)更加相似。此模型豐富了對BBB特性的相關(guān)知識，同時在展示BBB結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性的研究中更具有代表性。模型制備是將BMEC、星形膠質(zhì)細胞和周細胞共同培養(yǎng)成為管狀結(jié)構(gòu)，進行屏障功能鑒定及檢測后可用于相關(guān)實驗的研究。

由于單層細胞模型跨內(nèi)皮細胞電阻(transendothelial electrical resistance， TEER)較低，與體內(nèi)實際數(shù)值差距較大且模型滲透性較高，體內(nèi)外相關(guān)性較差，因此現(xiàn)在很少應(yīng)用；而三維模型由于培養(yǎng)復(fù)雜、成本較高，沒有被廣泛利用。目前比較通用的BBB體外模型是按照其在體內(nèi)的解剖結(jié)構(gòu)將BMEC和星形膠質(zhì)細胞進行共培養(yǎng)。大量研究表明星形膠質(zhì)細胞在BBB功能維持方面有輔助作用。自從BMEC與星形膠質(zhì)細胞之間的相互作用被廣泛利用，BMEC與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)模型已經(jīng)成為BBB研究領(lǐng)域最為普及的模型，其特點是可以直接反映BBB的功能狀態(tài)及細胞間的相互作用，并且不受其他生理因素的影響。此模型具有較高的跨內(nèi)皮細胞電阻值、較低的通透性以及表達多種轉(zhuǎn)運蛋白。它不僅適用于基礎(chǔ)實驗的研究，在臨床藥物選擇實驗中也有著不可替代的作用。

然而，體外模型不可能全面還原體內(nèi)模型的各種特性并且會限制BMEC的許多功能。從體外模型中獲得的實驗數(shù)據(jù)需要考慮到不同細胞對實驗結(jié)果的影響，還要考慮到細胞間的相互作用以及體內(nèi)和體外模型之間的差異。盡管體外模型可以提高我們對屏障功能的認識，但將體外模型的研究成果還原于體內(nèi)并應(yīng)用到實際臨床實踐中的可能性仍有待觀察，這也成為了諸多學(xué)者今后的研究方向。

BBB是一個動態(tài)系統(tǒng)，能夠反映腦內(nèi)的局部變化以及物質(zhì)需求，可以通過一系列的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及細胞間的相互作用來調(diào)控大腦在生理及病理情況下的功能，如調(diào)控緊密連接蛋白的功能以及多種轉(zhuǎn)運蛋白和酶類活性的表達。在保護循環(huán)物質(zhì)，調(diào)節(jié)營養(yǎng)供需以及修飾局部修復(fù)等方面，BBB的調(diào)節(jié)是迅速且有效的。值得強調(diào)的是BMEC及其相關(guān)細胞在BBB功能調(diào)節(jié)過程中起著重要的作用。盡管對于BBB在結(jié)構(gòu)和功能上有了一些了解，但就機體的復(fù)雜性所導(dǎo)致BBB的其他功能特性還有待進一步探討。

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國家自然科學(xué)基金資助項目(№.81171076)

150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科(周曼、李文志)；黑龍江省麻醉與危重病研究重點實驗室(楊萬超)； 黑龍江省高校麻醉基礎(chǔ)理論與應(yīng)用研究重點實驗室(劉翔、于淼、李文志)

李文志， E-mail：wenzhili9@126.com

10.3969/j.issn.1671-6450.2014.06.039

2013-09-27)