羅 蕓，張新宇，萬東君，劉曉花，付學(xué)鋒

攜帶LMO3基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其在NIH/3T3細(xì)胞中的表達(dá)

羅 蕓，張新宇，萬東君，劉曉花，付學(xué)鋒

目的構(gòu)建單純LIM蛋白3(LMO3)的逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體，并觀察其在NIH/3T3細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法 重組載體pLXSN-LMO3經(jīng)酶切及測序鑒定后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到pA317包裝細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)定的病毒產(chǎn)生細(xì)胞株。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒體外感染NIH/3T3，并對其進(jìn)行病毒滴度檢測，NIH/3T3細(xì)胞分為3組:以pLXSN-LMO3轉(zhuǎn)染為實驗組，以pLXSN轉(zhuǎn)染為陰性對照組，正常細(xì)胞為空白對照組。采用免疫熒光組化染色和蛋白印跡(Western blot)法鑒定NIH/3T3細(xì)胞中LMO3的表達(dá)。結(jié)果 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-LMO3經(jīng)酶切及測序鑒定構(gòu)建正確，其病毒滴度平均可達(dá)4.04×106cfu/ml，各組NIH/3T3細(xì)胞免疫熒光組化染色及Western blot檢測均有LMO3蛋白表達(dá)，其中實驗組高表達(dá)LMO3，與陰性對照組、空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 成功構(gòu)建了攜帶LMO3基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并能在NIH/3T3細(xì)胞中高表達(dá)LMO3蛋白，為下一步開展基因治療奠定了基礎(chǔ)。

單純LIM蛋白3;NIH/3T3細(xì)胞;逆轉(zhuǎn)錄病毒科感染;pLXSN

LIM蛋白是一類富含半胱氨酸且有一個或多個鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白家族，含有一段高度保守氨基酸序列 CX2CX17-19HX2CX2CX16-20CX2C/H/D，即 LIM結(jié)構(gòu)域［1］。單純LIM蛋白(LIM domain only，LMO)有N末端兩個串聯(lián)的LIM結(jié)構(gòu)域和C末端其他序列組成，因無DNA結(jié)合的同源結(jié)構(gòu)域，必須與其他多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子結(jié)合形成復(fù)合物，在機體的分化和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［2］。本實驗構(gòu)建了LMO3的逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體，篩選出穩(wěn)定的產(chǎn)毒細(xì)胞株，并且通過感染NIH/3T3細(xì)胞，用免疫組化染色及蛋白印跡(Western blot)法檢測其蛋白表達(dá)情況，為下一步開展基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I、T4 DNA連接酶及其他各種工具酶均購自TaKaRa公司;Taq Plus IDNA聚合酶、dNTPS購自上海生工生物公司;LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒購自安徽優(yōu)晶生化工程有限公司;DMEM/F12培養(yǎng)基、G418購自Gibco公司;胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;菌株E.coil DH5α、質(zhì)粒pEGFP-cl-LMO3、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLXSN、兔抗人LMO3多克隆抗體、pA317細(xì)胞株和NIH/3T3細(xì)胞株均為筆者所在實驗室保存。兔抗β-Actin單克隆抗體、羊抗兔IgG/TRITC為上海中山生物公司產(chǎn)品。LMO3的引物合成及基因測序均由上海生工生物公司完成。上游引物5＇-TAGAATTCTATGCTCTCAGTTCAGCCAG-3＇(EcoR I);下游引物 5＇-TAGGATCCGATGTAGTGCTTTGCATTGTTGG-3＇(BamH I)。HF90型CO2恒溫培養(yǎng)箱為上海力申公司產(chǎn)品;IX71型熒光倒置生物顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品;D77型凝膠成像分析系統(tǒng)為英國UVITEC公司產(chǎn)品;ChemiDoc型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)為美國UVP公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 攜帶LMO3基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建:質(zhì)粒pEGFP-cl-LMO3及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLXSN，經(jīng)EcoR I及BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段。將雙酶切后的LMO3片段和pLXSN載體按2∶1混合后，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)菌，涂勻于氨芐西林抗性LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取克隆菌落，擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒分別進(jìn)行 EcoR I及BamH I雙酶切和PCR鑒定，LMO3酶切片段委托上海生工生物公司進(jìn)行測序。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:取pA317對數(shù)生長期細(xì)胞，按1×105個/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書方法，NIH/3T3細(xì)胞為空白對照組，將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-LMO3(實驗組)和陰性對照載體pLXSN(陰性對照組)轉(zhuǎn)染至pA317包裝細(xì)胞。無血清、無雙抗的DMEM培養(yǎng)基37℃、50 m l/L CO2培養(yǎng)4 h，更換含100 ml/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后傳代并以0.9 g/L濃度的G418進(jìn)行抗性篩選，每3 d換液1次。連續(xù)培養(yǎng)2周后，大量非轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡，更換為含0.4 g/L G418的培養(yǎng)基繼續(xù)抗性穩(wěn)定篩選，直至克隆出現(xiàn)。采用有限稀釋法培養(yǎng)至單克隆出現(xiàn)后，進(jìn)行擴(kuò)增穩(wěn)定傳代。當(dāng)轉(zhuǎn)染的pA317細(xì)胞融合達(dá)80%左右時，更換無G418培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，回收培養(yǎng)上清，0.45μm低蛋白吸附，醋酸纖維濾膜過濾，獲得逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，-70℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒上清病毒滴度測定:在24孔培養(yǎng)板中，按照1×105個/孔接種NIH/3T3細(xì)胞(空白對照組)及以pLXSN-LMO3、pLXSN轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞(實驗組、陰性對照組)，100 ml/L胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)1 d。更換為無血清、無雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，分別按照加入 10、102、103、104、105、106倍稀釋的病毒上清及陰性對照上清100μl，最后各加入終濃度為4 mg/L Polybrene。37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)24 h，胰酶消化細(xì)胞，按照1∶20稀釋傳代，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，加入200 mg/L G418繼續(xù)篩選2周。觀察克隆形成情況，最后40 g/L多聚甲醛固定，Giemsa染色，對抗性細(xì)胞克隆數(shù)計數(shù)，以計算病毒滴度，單位以cfu/ml表示。

1.2.4 免疫組化染色檢測NIH/3T3細(xì)胞中LMO3的表達(dá):將 NIH/3T3細(xì)胞(空白對照組)及感染pLXSN-LMO3、pLXSN的 NIH/3T3細(xì)胞(實驗組、陰性對照組)胰酶消化后，在多聚賴氨酸預(yù)處理過的蓋玻片上爬片生長24 h。以預(yù)冷40 g/L多聚甲醛固定液固定 5 min，室溫晾干。PBS漂洗3次，5 min/次。封閉液(10 g/L BSA+4 ml/L Triton X-100)37℃封閉30 min。加入1∶400稀釋的兔抗人LMO3多克隆抗體37℃孵育2 h。PBS漂洗，加入1∶400稀釋的羊抗兔-TRITC抗體37℃孵育3 h。PBS漂洗，700 ml/L甘油封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.5 Western blot法檢測NIH/3T3細(xì)胞中LMO3的表達(dá):以pLXSN-LMO3轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞為實驗組，pLXSN轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為陰性對照組，NIH/3T3細(xì)胞為空白對照組。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑(PMSF)的RIPA裂解液，冰水浴中裂解30 min。用BCA法對樣品蛋白定量，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離。300 mA電轉(zhuǎn)1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至 NC膜，脫脂奶粉封閉過夜。TBST清洗3次，5 min/次。分別加入1∶400稀釋的兔抗人LMO3多克隆抗體和β-actin抗體，37℃孵育2 h。TBST清洗，加入1∶500稀釋的羊抗兔-HRP抗體，4℃過夜。TBST清洗后，滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，ChemiDoc型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像并進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體構(gòu)建及PCR鑒定 對重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-LMO3經(jīng)EcoR I及BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，拍照后觀察，獲得了大小約為478 bp的目的條帶;以重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同樣獲得了大小約為478 bp的陽性目的片段，與引物設(shè)計的LMO3大小一致(圖1)。經(jīng)進(jìn)一步測序證實基因序列完全正確(GenBank登錄號:AF258348)，測序結(jié)果未顯示。

圖2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pA317細(xì)胞系建立

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒pA317細(xì)胞的建立 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pA317包裝細(xì)胞后，加入0.9 g/L G418進(jìn)行抗性篩選，1周后3組細(xì)胞均開始出現(xiàn)死亡。2周后，空白對照組細(xì)胞基本全部死亡，陰性對照組、實驗組均有少量細(xì)胞存活，并形成小克隆，更換G418濃度為0.4 g/L進(jìn)行穩(wěn)定篩選，繼續(xù)培養(yǎng)3周后形成多個明顯的克隆，見圖2。挑取細(xì)胞克隆，有限稀釋于96孔板，繼續(xù)加入0.4 g/L的G418培養(yǎng)，待形成單克隆后，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)并穩(wěn)定傳代。

圖1 重組質(zhì)粒pLXSN-LMO3鑒定

2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的測定 轉(zhuǎn)染后的pA317細(xì)胞經(jīng)G418穩(wěn)定篩選后陰性對照組、實驗組分別獲得了11個和23個較大的單克隆。有7株pLXSNLMO3和3株pLXSN為高產(chǎn)毒株。實驗組病毒滴度為(4.04±1.87)×106cfu/ml，陰性對照組病毒滴度為(6.81±2.11)×106cfu/ml。

2.4 免疫組化染色檢測 NIH/3T3細(xì)胞中LMO3的表達(dá)，鏡下觀察發(fā)現(xiàn):實驗組可見明顯的強紅色熒光，主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，在核周亦見少量的分泌表達(dá);而陰性對照組及空白對照組僅有極個別細(xì)胞可見到極弱熒光，且熒光分布在整個細(xì)胞內(nèi)，應(yīng)為熒光染料非特異性染色所致。見圖3。

圖3 感染后NIH/3T3細(xì)胞免疫熒光組化染色(TRITC×200)空白對照組、陰性對照組、實驗組為NIH/3T3細(xì)胞及以pLXSN、pLXSN-LMO3轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞

2.5 Western blot法檢測NIH/3T3細(xì)胞中LMO3的表達(dá)情況 3組均可見大小約為18 kD的單一蛋白免疫反應(yīng)條帶，與文獻(xiàn)報道的LMO3蛋白分子大小一致，見圖4。以β-actin為內(nèi)參照，通過成像分析軟件分析3組LMO3的相對于β-actin的表達(dá)量，實驗組(1.100±0.082)相對于陰性對照組(0.093±0.005)和空白對照組(0.104±0.008)高表達(dá)LMO3蛋白，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖4 Westernblot法檢測感染pLXSN-LMO3病毒NIH/3T3細(xì)胞LMO3的表達(dá)空白對照組、陰性對照組、實驗組為NIH/3T3細(xì)胞及以pLXSN、pLXSN-LMO3轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞

3 討論

LMO為LIM蛋白家族成員，該類蛋白是一種蛋白相互作用的適配器，其LIM結(jié)構(gòu)域在不同組織、器官及生物的不同發(fā)育時期可與核內(nèi)廣泛分布的LIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(Ldb)及其他的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，進(jìn)而調(diào)控特定的下游靶基因的表達(dá)［3-5］。LMO蛋白家族成員包括 LMO1～4，在胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)形成、腦發(fā)育和紅細(xì)胞的生成等過程中擔(dān)當(dāng)重要角色，并且與成神經(jīng)細(xì)胞瘤等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［6］。LMO1和LMO2最早發(fā)現(xiàn)于急性T細(xì)胞白血病(T-ALL)時，被轉(zhuǎn)位至染色體上T細(xì)胞受體位點，是T細(xì)胞癌蛋白［7-8］。LMO4特異性分布在乳腺中，主要作用是抑制乳腺表皮細(xì)胞的分化，與乳腺癌的發(fā)生、增殖以及預(yù)后都有密切的關(guān)系［9-11］。LMO3主要廣泛存在于腦、脊髓腹側(cè)、三叉神經(jīng)元、視網(wǎng)膜等組織中，主要調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育和分化，同時參與成神經(jīng)細(xì)胞瘤等腫瘤的形成和轉(zhuǎn)錄調(diào)控［12-17］，但是關(guān)于LMO3更多的生物學(xué)功能有待進(jìn)一步的研究。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，逆轉(zhuǎn)錄病毒具有相當(dāng)高的感染效率，分裂期的靶細(xì)胞幾乎可以100%地被轉(zhuǎn)染，且外源性基因可以整合到靶細(xì)胞染色體中，在靶細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。該系統(tǒng)具有寄主廣泛、導(dǎo)入基因拷貝數(shù)多、免疫原性較低、轉(zhuǎn)染效率高、外源基因表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點［18］。

本研究中選取的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN是由Miller等在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體N2基礎(chǔ)上構(gòu)建的新一代載體，獲美國FDA臨床試驗許可證［19-20］。采用直接連接方式構(gòu)建重組病毒，不需進(jìn)行空斑化，避免了陰性重組病毒，提高了重組效率。含有多個克隆位點，降低了同源重組的概率，使基因轉(zhuǎn)移隱患降低，具有較高的安全性。在構(gòu)建過程中，其導(dǎo)入的外源基因上游含有啟動子，下游連接終止密碼子，可形成完整而穩(wěn)定的表達(dá)框，既可經(jīng)過包裝后瞬時表達(dá)，產(chǎn)生較高滴度的重組病毒顆粒，同時又因帶有Neo基因，在G418穩(wěn)定篩選的作用下，感染細(xì)胞可以持久存活并且持續(xù)表達(dá)外源目的基因蛋白，而且因其不表達(dá)任何具有免疫原性的病毒蛋白，所以引起機體的免疫反應(yīng)低［21］。

本實驗成功構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pLXSN-LMO3，PCR和雙酶切鑒定其目的基因LMO3導(dǎo)入正確，經(jīng)測序檢測基因序列未見有插入、重排、缺失等突變。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染成功導(dǎo)入了包裝細(xì)胞系pA317，經(jīng)G418長時間穩(wěn)定篩選獲得了多株穩(wěn)定表達(dá)的單克隆高產(chǎn)毒細(xì)胞株，其病毒平均滴度為4.04×106cfu/ml，最高滴度為 1.24 ×107cfu/ml。重組逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pLXSN-LMO3構(gòu)建正確，且成功感染NIH/3T3細(xì)胞，免疫熒光組化染色觀察，可在靶細(xì)胞核內(nèi)合成、表達(dá)及分泌LMO3蛋白。Western blot實驗進(jìn)一步證實了感染的靶細(xì)胞高表達(dá)LMO3蛋白，與陰性對照組和空白對照組比較差異顯著。

綜上所述，本實驗得到了穩(wěn)定感染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的LMO3的NIH/3T3細(xì)胞，并且對表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)MO3進(jìn)行了檢測，為下一步研究LMO3的生物學(xué)功能、腫瘤細(xì)胞體外實驗及其基因治療等方面奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of Recombinant Retroviral Vector Carrying LMO3 Gene and Its Expression in NIH/3T3 Cells

LUO Yun，ZHANG Xin-yu，WAN Dong-jun，LIU Xiao-hua，F(xiàn)U Xue-feng(Departmentof CadreWards，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command，Lanzhou 730050，China)

ObjectiveTo construct recombinant retroviral vector carrying LIM domain only 3(LMO3)gene and study its expression in NIH/3T3 cells.MethodsThe retroviral vector pLXSN-LMO3 was identified by restriction enzyme analysis and DNA sequencing analysis，and then was transfected into retrovirus packaging cell line pA317，and G418 was used to select stable virus-producing cell lines.The recombinant retroviruswas used to infect NIH/3T3 cells in vitro，and the value of viral titerwas determined.The NIH/3T3 cellswere divided into three groups:experimental group(infected with the pLXSN-LMO3)，negative control group(infected with the pLXSN)and control group.The expression of LMO3 in NIH/3T3 cells was identified by the immunofluorescence histochemistry and Western blotmethods.ResultsThe pLXSN-LMO3 recombinant retroviral vector had been constructed correctly by restriction enzyme analysis and sequencing analysis，and the value of titer assayed on NIH3T3 cellswas up to an average of 4.04×106cfu/ml.LMO3 albumen expression was detected in NIH/3T3 cells using immunofluorescence histochemistry and Western blotmethods，and LMO3 was highly expressed in experimental group，and the differences in LMO3 expression were statistically significantwhen compared with those in negative control group and control group(P＜0.05).ConclusionThe recombinant retroviral vector carrying LMO3 gene has been constructed successfully，which can highly express LMO3 in NIH/3T3 cells and has potential utility in further gene therapy.

LIM domain only 3;NIH/3T3 cell;Retroviridae infection;pLXSN

R512.99

A

2095-140X(2014)05-0022-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2014.05.006

甘肅省自然科學(xué)基金資助項目(1107RJZA106)

730050蘭州，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院干部病房

付學(xué)鋒，E-mail:lkyyfxf@126.com

2013-12-16 修回時間:2014-01-28)

藥物分析
·論著·