周雪花

云南省文山州疾病預防控制中心，云南文山663000

實時熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應用

周雪花

云南省文山州疾病預防控制中心，云南文山663000

目的探討實時熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應用效果。方法選取2009年9月—2013年12月在我州采集的流感樣病例咽拭子2489件進行分析，采用實時熒光定量PCR對流感病毒核酸進行檢測，觀察檢測陽性率和陽性樣本的類型，以分析流感的流行趨勢。結果2009年9月—2013年12月共檢出流感病毒核酸陽性676件，檢測陽性率為27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季節(jié)性甲3亞型病毒126件，占7.54%；季節(jié)性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，占0.89%；各類型流感病毒發(fā)生率之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。每年6～9月甲型H1N1病毒流感呈上升趨勢，在10～11月達到高峰期；6～9月以季節(jié)性甲3亞型病毒為主要流行病株，10～11月甲型H1N1病毒成為主要流行病株。結論實時熒光定量PCR是一種科學有效的檢測方法，可對流感病毒核酸進行快速、準確的檢測，分析流感病毒的流行規(guī)律，有效預防突發(fā)公共衛(wèi)生事件的發(fā)生。

實時熒光定量PCR；流感；病毒核酸；檢測；應用

2009年3月份在墨西哥爆發(fā)甲型H1N1流感，并且迅速蔓延至全球，使人們意識到預防流感的重要性[1-2]。為了探討實時熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應用效果，本文選取2009年9月—2013年12月在我市某地區(qū)采集的流感樣病例咽拭子2489件作為研究對象進行分析，結果匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

資料來源于2009年9月—2013年12月在我州采集的流感樣病例咽拭子2489件。

1.2 方法

1.2.1 采集2489件咽拭子是擦拭雙側咽扁桃體和咽后壁，剪去一部分放置在無菌病毒采樣液中，以4℃的條件下保存，盡快送至實驗室，其中疑似甲型H1N1病毒的病例采用A類包裝。

1.2.2 試劑和儀器采用STRATAGENE MX3000P實時熒光定量PCR儀。試劑盒采用QIAGEN公司的RneasyMiniKit(Catalog#74104)病毒核酸提取試劑盒，及其配套的試劑，其陽性檢測結果對比參照試劑盒配套說明書。

1.2.3 檢測方法RT-PCR快速檢測試驗步驟

（1）流感病毒核酸提取—QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit(Catalog#74104)：①取一支無菌、無酶的1.5ml Eppendorf管，加入500ul RLT。②取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細胞培養(yǎng)液）100uL，加入上述Eppendorf管中。③加5uL β-巰基乙醇，充分混勻。④加600uL 70%乙醇，于旋轉混合器混勻。⑤從試劑盒中取出帶濾膜的離心柱，并標上標本號。⑥將第4步的混合液分兩次（每次600uL）吸入于濾柱中，12000rpm離心15 s，棄收集管中的離心液。⑦濾柱仍放回收集管上，將第4步的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm離心15 s，棄收集管中液體。⑧于濾柱中加入700uLRW1，12000rpm離心15 s。⑨從試劑盒中取出一支新的2 mL收集管，將離心后的濾柱轉到新的收集管上，于柱子中加入500ulRPE，12000rpm離心15 s棄收集管中液體。⑩濾柱放回收集管上，于濾柱中加入500uL RPE，13000～14000rpm離心2 min。11從試劑盒中取出一支1.5mL Eppendorf管，將濾柱轉到新的1.5mL管上，于濾柱中加入30～50uL無RNA酶的水，室溫靜置1～3 min。1212000rpm離心1 min，棄濾柱。收集的離心液即為提取病毒的RNA，可以直接用于逆轉錄實驗，或在-20℃以下保存，-30℃可保存3～4個月。

注意事項：①試劑盒中的RPE液用前需加44 mL無水乙醇，使終體積達到55 mL；②所有用過的槍頭、收集管放入2%次氯酸鈉消毒缸中過夜；③每步均需要更換槍頭。

（2）在潔凈緩沖間、二級生物安全柜配制RT—PCR(real time PCR)反應液。（以下均存-20℃）：

①一對特異引物和寡核苷酸探針（季節(jié)性FLuA、FLuB、H1、H3、H5、H7、H9等）。

手掌型離心機離心15～20 s后（防止突然開蓋引物和探針飄走），按各自標注的OD值加入無酶水，混勻，離心即為儲備液。依據(jù)說明書，各相應的一對特異引物（F、R）按2.5倍稀釋、寡核苷酸探針（P）按5倍（有的為10倍稀釋）即為使用液

②各季節(jié)性流感反應體系（按n+2用量配制）及其反應條件(需根據(jù)引物調整)。

RT-PCR Master Mix12.5uL60℃5min/50℃30min/95℃15min(1個循環(huán))

RT-Mix0.25uL95℃15s/55℃30s/(收集熒光)/72℃30 s

DH2O5.75uL（45個循環(huán)）

F(5′上游引物使用液)0.5uL72℃5 min（1個循環(huán)）

R(3′下游引物使用液)0.5uL

P（寡核苷酸探針使用液）0.5uL

③新甲型H1N1(豬甲流-2009)—北京金豪試劑反應體系（按n+ 2用量配制）及其反應條件。

H1N1各反應液2000 rpm離心10 s50℃30min/95℃3 min（1個循環(huán)）

（FLuA、SWH1、SWF FLuA、RNP內標）各20 uL95℃15s/50℃30s/72℃1 min

各反應液分別加逆轉錄酶0.35 uL（5個循環(huán)）

DNA聚合酶1 uL

（混勻離心）95℃10s/55℃40s(收集熒光)（45個循環(huán)）

于提取間，反應體系20 uL+模板RNA提取液5 uL。進行PCR擴增反應。陽性：Ct值＜35.0，并且呈現(xiàn)S形曲線,陰性：Ct值為0。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，用（±s）表示，P＜0.05說明具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 流感病毒核酸檢測陽性率

2009年9月—2013年12月的2489件流感樣病例咽拭子中，共檢出流感病毒核酸陽性676件，陽性檢出率為27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季節(jié)性甲3亞型病毒126件，占7.54%；季節(jié)性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，占0.89%；各類型流感病毒發(fā)生率之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果見表1。

表1 流感病毒核酸檢測陽性率

2.2 流感病毒流行特征

每年6～9月甲型H1N1病毒流感呈上升趨勢，在10月～次年3月達到高峰期；6～9月以季節(jié)性甲3亞型病毒為主要流行病株，10月～次年3月甲型H1N1病毒成為主要流行病株。

3 討論

流感之一種急性呼吸系統(tǒng)疾病，主要由流感病毒引起，臨床癥狀主要表現(xiàn)為高熱、酸痛、乏力、呼吸道癥狀等。流感傳染性強、潛伏期短、傳播迅速，可分為甲、乙、丙三種類型，其中以甲型流感對人們的威脅最大[3-4]，因而必須加強對流感的檢測和防控。

流感病毒致病能力較強，而且容易發(fā)生變異，而且人們對特異性菌株缺乏必要的免疫力，因而會導致流行暴發(fā)。相關研究表明，一場大型流感會導致整個地區(qū)的壽命降低[5]，因而必須加強流感的防控，為此我市疾病防控中心采用實時熒光定量PCR對流感病毒核酸進行檢測，取得了良好的效果。

實時熒光定量PCR檢測具有明顯的優(yōu)點，相比于普通的RT-PCR檢測來說，其實驗周期更短，靈敏度更低，而且不容易造成實驗室污染[6]。實時熒光定量PCR檢測能夠利用PCR對DNA的高效擴增、光譜技術的敏感性和探針技術的特異性，敏感性較高，重復性好，而且更為直觀，操作簡單，容易操作，采用閉管檢測對實驗室的污染能夠降到最低，因而具有良好的實用性；采用磁珠法進行提取核酸，能夠最大限度的結合核酸，而且清洗效率高，能夠實現(xiàn)自動化提取，操作方便[7-8]。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，2009年9月—2013年12月共檢出流感病毒核酸陽性676件，檢測陽性率為27.16%；其中甲型H1N1病毒最多，各類型流感病毒發(fā)生率之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外，每年9月～次年的3月甲型H1N1病毒流感呈上升趨勢。這充分證明了實時熒光定量PCR檢測的優(yōu)勢。

但是在實驗室檢測中要注意以下幾點：①要對實驗室區(qū)域進行嚴格區(qū)分，不同實驗區(qū)域采取不同的專屬器械；②在樣品提取后能夠進行立刻檢測的要進行立刻檢測，否則會降低檢驗的準確率，如果無法立即進行檢測要進行冷凍保存；③整個檢測過程要在低溫環(huán)境下進行；④移動液也進行嚴密的校準，操作過程要熟練，防止發(fā)生遺漏事件的發(fā)生；⑤要注重檢測過程中的污染問題，采取75%的乙醇對實驗臺面進行擦拭，對周圍環(huán)境采取紫外線消毒，以減少污染的發(fā)生[9]；⑥另外，相關研究也證明[10]，盡管檢測流感病毒核酸的試劑和儀器很多，但是并不是所有的試劑與儀器都能達到的最好的匹配，因此，在進行實驗室檢測時還要多次進行校準試驗，針對不同的試劑和儀器進行匹配性試驗比較，找出最佳匹配方案，使實時熒光定量PCR的檢測結果更加快速、準確，敏感性、特異性更高。

綜上所述，實時熒光定量PCR是一種科學有效的檢測方法，可對流感病毒核酸進行快速、準確的檢測，分析流感病毒的流行規(guī)律，有效預防突發(fā)公共衛(wèi)生事件的發(fā)生。

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[3]陳棋炯，孫永祥，丁水軍，等.應用實時熒光定量PCR技術快速檢測甲型H1N1流感病毒[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，1(6)：1394-1396.

[4]區(qū)偉全，盧國鈞.實時熒光定量PCR在鐵路運輸動物攜帶甲型流感病毒檢測中的應用[J].熱帶醫(yī)學雜志，2011，11(7)：828-829.

[5]郭泗虎，王文華，張亮權，等.H3亞型豬流感病毒SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2012，34(2)：124-127.

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[7]尹航，楊煥良，陳艷，等.甲型H1N1流感病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2013，35(1)：36-39.

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R440

A

1672-5654（2014）10（a）-0178-02

2014-08-05）

周雪花（1977-），女，漢族，本科，主管檢驗師，云南文山人，主要從事臨床檢驗，微生物檢驗工作。