薩仁托雅，張峰，鄭有虎，盧亞楠

(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室，遼寧大連116023)

近年來，食品安全方面的問題越來越多，食品中某些藥物的殘留問題受到了人們的高度重視。氯霉素可引起骨髓造血機能紊亂、視神經(jīng)炎、多發(fā)性神經(jīng)炎等癥狀，并可造成血小板減少、細(xì)胞減少性貧血［1］。呋喃唑酮會對人類造成潛在危害，可引起溶血性貧血、眼部損害和急性肝壞死等疾病。2002年，氯霉素和硝基呋喃類藥物被列入中國《食品動物禁用獸藥及其他化合物清單》，規(guī)定不得在水產(chǎn)品中檢出氯霉素、硝基呋喃類及其代謝物［2］。

目前，藥物殘留檢測技術(shù)主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［3］(GC-MS)、液相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法［4］(LC-MS)、酶聯(lián)免疫法［5］(ELISA)、放射性免疫測定法［6-7］(RIA)等。GC-MS、LC-MS法可準(zhǔn)確定量農(nóng)藥殘留量且靈敏度高，但操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴;RIA法中標(biāo)記物易衰變且具有放射性污染;ELISA法雖操作方便快捷，但檢出限較高?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析 (CLEIA)技術(shù)是近年來發(fā)展較快的新型檢測技術(shù)，該技術(shù)集化學(xué)發(fā)光的高靈敏度和免疫分析的高特異性于一體，具有無污染、特異性強、檢出限低、靈敏度高等特點，可快速大規(guī)模篩選樣品［8-9］。本研究中，對檢測水產(chǎn)品藥物殘留的化學(xué)發(fā)光免疫分析和酶聯(lián)免疫分析兩種方法進行了比較研究，旨在為化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的實際應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

30%過氧化氫、魯米諾 (luminuol)、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、鹽酸 (HCl)等藥品購于上海生工生物有限公司;呋喃唑酮代謝物 (AOZ)、氯霉素 (CAP)ELISA檢測試劑盒，以及試驗所用抗原包被的96孔酶標(biāo)板、AOZ與CAP多克隆抗體、HRP-AOZ與HRP-CAP標(biāo)記復(fù)合物、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、洗液、標(biāo)準(zhǔn)品等均由深圳綠詩源公司提供。

Centro LB960微孔板式發(fā)光儀購自德國Berthold公司，ELx808 Ultra Microplate Readers酶標(biāo)儀購自美國伯騰 (Bio-tek)公司，WZ-A微量振蕩器由常州澳華儀器有限公司生產(chǎn)，恒溫水浴鍋購于上海亞榮生化儀器廠，高速分散機ULTRATURRAX購于IKA公司。

1.2 方法

1．2．1 藥品的配制 發(fā)光底物 A:用0．1 mol/L NaHCO3將5 mmol/L魯米諾原液稀釋成濃度為0．5 mmol/L的溶液。發(fā)光底物B:用0．1 mol/L Tris-HCl(pH 8．5)將 30%H2O2稀釋成濃度為 5 mmol/L的溶液，使用前按1∶1混合［10-11］。

1．2．2 樣品的前處理 取待測樣品可食用部分，用搗碎機搗碎后再用高速分散機勻漿。

(1)呋喃唑酮代謝物的提取。分別稱取(1．00±0．05)g魁蚶、仿刺參、蝦夷扇貝、菲律賓蛤仔組織樣品，加入4 mL蒸餾水、0．5 mL 1 mol/L HCl和100 μL衍生化試劑，充分振蕩，56℃水浴中孵育 2 h;再加入 5 mL 0．1 mol/L K2HPO4、0．4 mL 1 mol/L NaOH和5 mL乙酸乙酯，充分振蕩5 min，室溫下以4000 r/min離心10 min;取2．5 mL上層液體加入到另一個容器中，50℃下用氮氣吹干，加入1 mL正己烷溶解干燥物，再加入1 mL樣本復(fù)溶液充分混合30 s，室溫下以4000 r/min離心10 min，取50 μL下層液體進行分析。

由于海膽中酯含量較高，不宜用乙酸乙酯提取殘留藥物，所以應(yīng)先稱取 (1．00±0．05)g海膽樣品，加入4．5 mL甲醇和0．5 mL去離子水，振蕩2 min，以4000 r/min離心5 min，傾倒出全部液體，再加5 mL乙腈和5 mL正己烷，振蕩2 min，以4000 r/min離心5 min，傾倒出全部液體，留固體沉淀部分，再按照上述方法提取呋喃唑酮代謝物。

(2)氯霉素的提取。分別稱取 (3．00±0．05)g魁蚶、仿刺參、蝦夷扇貝、菲律賓蛤仔組織樣品，加入3 mL去離子水混勻，再加入6 mL乙酸乙酯，振蕩2 min，室溫下以4000 r/min離心10 min;取4 mL上層液體加入到另一容器中，50℃下用氮氣吹干，加入1 mL正己烷溶解干燥物，再加入1 mL樣本復(fù)溶液混合30 s，室溫下以4000 r/min離心10 min，取50 μL下層液體進行分析。

海膽中氯霉素的提取方法:稱取 (3．00±0．05)g海膽樣品，加入9 mL乙腈-水 (84 mL∶16 mL)溶液振蕩2 min，室溫下以4000 r/min離心10 min;取3 mL上層相與3 mL去離子水混合，加入 4．5 mL乙酸乙酯，混合 1 min，室溫下以4000 r/min離心10 min;取上層有機相，50℃下用氮氣吹干，再按照上述氯霉素提取方法進行提取。

地域文學(xué)和文化研究與教學(xué)的對接有利于培養(yǎng)學(xué)生對科研的興趣，使他們更為直觀地了解和接受科研的方法。今天的學(xué)生即是未來的文化繼承者和傳播者，地域文學(xué)和文化教育以教師科研的現(xiàn)身說法介紹運用中西方各種理論的、實證的、審美的方法，努力培養(yǎng)學(xué)生的人文素質(zhì)和對文學(xué)和文化學(xué)習(xí)、研究的興趣，培養(yǎng)學(xué)生思考問題、解決問題和創(chuàng)新創(chuàng)造的素質(zhì)能力。

1．2．3 CLEIA和ELISA方法 CLEIA法檢測步驟詳見文獻［12］，ELISA法檢測步驟詳見ELISA試劑盒說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 CLEIA和ELISA檢測方法的批內(nèi)、批間精密度

在一次測定中，取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度下均進行5次重復(fù)測定，計算批內(nèi)變異系數(shù)(RSD);分別以5個批次測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，計算批間RSD。從表1、表2可見:用CLEIA法檢測CAP的批內(nèi)、批間 RSD分別為5．5% ～11．3%和12．3% ～20．9%，用 ELISA法檢測 CAP的批內(nèi)、批間 RSD 分別為 1．6% ～5．9%和 8．9% ～13．4%;用CLEIA法檢測AOZ的批內(nèi)、批間RSD分別為6．6% ～11．1%和15．6% ～18．3%，用 ELISA 法檢測AOZ的批內(nèi)、批間RSD分別為4．9% ～6．3%和14．2% ～15．0%。雖然用 CLEIA法檢測的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均高于ELISA法，但仍符合《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑 (盒)備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》(農(nóng)醫(yī)發(fā)［2005］17號文件)的規(guī)定。該標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定:每批平行樣之間的變異系數(shù) (批內(nèi)變異系數(shù))不得大于25%，對于禁用藥物不得大于30%，而樣品之間的變異系數(shù)值 (批間變異系數(shù))不得大于30%，對于禁用藥物不得大于40%。

2.2 CLEIA和ELISA檢測方法的添加回收率

將不同濃度的AOZ、CAP添加到空白仿刺參勻漿組織中，每個濃度下進行5次重復(fù)測定，分別測定兩種方法的添加回收率。從表3可見:用CLEIA法檢測 AOZ、CAP的回收率分別為90．7% ～ 111．9% 和 83．7% ～ 115．8%;用 ELISA法檢測 AOZ、CAP的回收率分別為 84．4% ～106．7%和85．3% ～111．3%，兩種方法的回收效果相當(dāng)。

表1 CLEIA法檢測CAP和AOZ的批內(nèi)和批間精密度 (n=5)Tab.1 Intra－ and inter－assay precisions of CAP detection by chemiluminescence immunoassay(n=5)

表2 ELISA法檢測CAP和AOZ的批內(nèi)和批間精密度 (n=5)Tab.2 Intra－ and inter－assay precisions of AOZ detection by enzyme－linked immunosorbent assay(n=5)

表3 CLEIA和ELISA法檢測AOZ和CAP的添加回收率Tab.3 Added recovery of CAP and AOZ detection by CLEIA and ELISA methods μg/kg

2.3 CLEIA和ELISA檢測方法的相關(guān)性分析

對兩種分析方法的添加回收率測定結(jié)果進行線性回歸分析 (圖1)，結(jié)果表明，測定AOZ的回歸方程為

y=0．05356+0．90324x(r2=0．9899)，

測定CAP的回歸方程為

y=0．03698+1．03212x(r2=0．9636)。

說明CLEIA與ELISA兩種方法具有很好的相關(guān)性，可以準(zhǔn)確篩選樣品組織中AOZ和CAP殘留。

圖1 CLEIA和ELISA法測定AOZ和CAP的相關(guān)性曲線Fig.1 Correlation comparison of AOZ and CAP detection by CLEIA and ELISA methods

2.4 用CLEIA法檢測水產(chǎn)品中CAP和AOZ的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

測定20份空白仿刺參樣品中CAP和AOZ的含量，計算出每種樣品中CAP和AOZ的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，最低檢出限等于空白樣品檢測平均值加上3倍空白樣品檢測值的標(biāo)準(zhǔn)差。如圖2所示，用CLEIA法檢測水產(chǎn)品中AOZ和CAP，其線性方程分別為y=18747-7317x和 y=15102-1865x，其線性范圍分別為 0．01 ～ 2．56、0．025 ～6．400 μg/kg，檢出限分別為 0．01、0．016 μg/kg。用 ELISA法檢測水產(chǎn)品中AOZ和CAP，檢出限分別為0．10、0．05 μg/kg，線性范圍分別為 0．10 ～1．62、0．05 ～4．05 μg/kg。

圖2 CLEIA法檢測AOZ和CAP的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of CLEIA method for determination of AOZ and CAP

2.5 用CLEIA法檢測5種水產(chǎn)品中CAP和AOZ的殘留量

用CLEIA法檢測5種水產(chǎn)品中CAP、AOZ的殘留情況如表4所示。其中，仿刺參和海膽中未檢測出CAP殘留，而菲律賓蛤仔、魁蚶、蝦夷扇貝3種貝類中都不同程度地檢測出CAP殘留。5種水產(chǎn)品食用組織中幾乎沒有AOZ的存在。

3 討論

本研究中通過對兩種藥物殘留進行檢測，結(jié)果表明，用CLEIA法檢測的線性范圍和檢出限均優(yōu)于ELISA法。馬玲等［13］建立了一步式檢測CAP殘留的CLEIA法，最低檢出限為0．01 μg/L;姚焱等［14］建立了檢測豬肉中CAP含量的CLEIA法，檢出限為0．018 ng/mL，而使用ELISA法的檢出限為0．177 ng/mL。本研究中，用CLEIA法檢測CAP的檢出限為0．016 μg/kg，這與以上研究結(jié)果基本一致。沈美芳等［15］運用ELISA法檢測水產(chǎn)品中AOZ代謝物，最低檢出限為0．3 μg/kg，而本研究中，用CLEIA法檢測水產(chǎn)品中AOZ的檢出限為0．01μg/kg，明顯優(yōu)于ELISA法。

表4 用CLEIA法檢測出的水產(chǎn)品中CAP和AOZ的殘留量Tab.4 The residue levels of AOZ and CAP in fish and fishery products by CLEIA μg/kg

通過比較批內(nèi)和批間變異系數(shù)可知，CLEIA法檢測兩種藥物的變異系數(shù)相對于ELISA法均偏高，這可能是由于發(fā)光液性能不夠穩(wěn)定所致，因此，需要進一步篩選優(yōu)化發(fā)光系統(tǒng)。另外，本研究中所用發(fā)光液不含發(fā)光增敏物質(zhì)，如果能在更優(yōu)化的發(fā)光系統(tǒng)中添加發(fā)光增敏物質(zhì)，可得到更高的檢測靈敏度。此外，在免疫試驗操作中，也應(yīng)避免環(huán)境和人為操作的影響，盡量縮短前后孔的加樣時間，避免漂移現(xiàn)象的產(chǎn)生，減少前后孔免疫反應(yīng)的差異。雖然CLEIA法檢出的變異系數(shù)較大，但其具有前處理簡單、高通量、檢出靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點，使其在樣品初篩檢測技術(shù)中具有絕對的優(yōu)勢［16］。

目前，對于禁用藥物CAP和硝基呋喃類代謝物，歐盟在水產(chǎn)品中制定的最低執(zhí)法限量 (Minimum required performance limit，MRPL)分別為0．3、1．0 μg/kg，中國規(guī)定為不得檢出，但中國檢測分析的靈敏度和檢測方法與歐盟存在一定的差距，水產(chǎn)品質(zhì)量不符合歐盟的要求，出口水產(chǎn)品屢遭受阻，經(jīng)濟損失嚴(yán)重。中國農(nóng)業(yè)部規(guī)定:用ELISA法檢測動物源性 CAP的檢出限為 0．05 μg/kg，定量限為 0．25 μg/kg［17］，高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中AOZ的檢出限為0．25 μg/kg，定量限為 0．5 μg/kg［18］。本研究中，3種貝類中CAP被不同程度地檢出，但由于CLEIA法屬于快速檢測初篩法，其檢出結(jié)果是否低于歐盟最低執(zhí)法限量，需要用GC-MS、LC-MS等方法確證。本研究結(jié)果顯示，個別地區(qū)可能還存在違規(guī)使用CAP的現(xiàn)象，需要相關(guān)部門加以監(jiān)督;而5種水產(chǎn)品食用組織中幾乎沒有AOZ代謝物的存在，符合歐盟及中國國家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

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［18］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部．農(nóng)業(yè)部781號公告-4—2006動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［S］．北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006．