顧偉 李春盛 殷文朋 張健 侯曉敏 張達(dá)

【摘要】目的 探討轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和T-bet的表達(dá)失衡是否參與了豬心肺復(fù)蘇后的急性肺損傷機(jī)制。方法 26頭豬隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為假手術(shù)組（SHAM）（6只）、復(fù)蘇12 h組和復(fù)蘇24 h組（各10只）。建立室顫8 min小型豬模型；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)豬外周血淋巴細(xì)胞（PBL）中CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺淋巴細(xì)胞亞群的分布；采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）方法檢測(cè)血漿中白細(xì)胞介素-4（IL-4），腫瘤壞死因子α （TNF-α）和干擾素γ（INF-γ）的含量；采用Western-blot法檢測(cè)肺組織GATA-3和T-bet的蛋白表達(dá)；用實(shí)時(shí)熒光PCR法定量肺組織GATA-3和T-bet mRNA水平。結(jié)果 復(fù)蘇組小豬發(fā)生嚴(yán)重肺組織細(xì)胞損傷，在復(fù)蘇后的12 h和24 h，豬血清中CD4⁺細(xì)胞的比例（28，4±2，3）%，（24，1±1，6）%明顯低于假手術(shù)組（48，4±2，9）%，（51，1±5，4）%；CD4⁺/CD8⁺（1，7±0，9），（1，5±1，0）也較假手術(shù)組明顯減低（2，5±1，3），（2，7±1，1）（P<0，05）；IL-4和TNF-α 水平在2～12 h逐漸升高（P<0，01）； INF-γ水平和INF-γ /IL-4卻在2～12 h逐漸降低。復(fù)蘇組的肺組織GATA-3的蛋白表達(dá)較假手術(shù)組分別在12 h、24 h明顯升高，T-bet的蛋白表達(dá)和T-bet/GATA-3則分別在12 h、24 h明顯降低。復(fù)蘇組的肺組織GATA-3和T-bet的mRNA水平較假手術(shù)組分別在12 h、24 h明顯升高和減低。結(jié)論 轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和T-bet的表達(dá)失衡導(dǎo)致的肺免疫功能障礙可能參與了心肺復(fù)蘇后急性肺組織損傷的過程。

【關(guān)鍵詞】心肺復(fù)蘇；急性肺損傷；Th1/Th2失衡；免疫功能障礙；GATA-3；T-bet

Role of imbalance between transcription factors GATA-3 and T-bet expressions in the pathogenesis of acute lung injury after resuscitation Gu Wei，Li Chunsheng，Yin Wenpeng，Zhang Jian，Hou Xiaomin，Zhang Da. Department of Emergency Medicine， Beijing Chaoyang Hospital， Capital Medical University， Beijing 100020， China

Corresponding author： Li Chunsheng， Email： banditgu@hotmail，com

【Abstract】Objective To study the role of imbalance between transcription factors GATA-3 and T-bet expressions in causing acute lung injury after resuscitation in cardiac arrest model of swine.Methods After swine model of electrically induced cardiac arrest was established for 8 minutes， animals were resuscitated to get restoration of spontaneous circulation （ROSC）. The swine with ROSC were randomly assigned to be sacrificed at 12 and 24 h after ROSC （n=8 in each group）. CD3⁺，CD4⁺ and CD8⁺ lymphocyte subsets were determined by flow cytometry， and the levels of serum IL-4，TNF-α，and IFN-γ were measured by using ELLSA. The protein levels and expressions of GATA-3/T-bet mRNA were detected in lung tissue by western blotting and quantitative real-time PCR device， respectively.Results Pulmonary function was significantly impaired after ROSC. CD4⁺ lymphocyte subsets（28，4±2，3）%，（24，1±1，6）%and CD4⁺/CD8⁺ （1，7±0，9），（1，5±1，0）were significantly lower in the post-ROSC group compared with the sham-operated group（48，4±2，9）%，（51，1±5，4）%（2，5±1，3），（2，7±1，1） （P<0，05） at 12 h and 24 h after ROSC. The levels of serum IL-4 and TNF-α were markedly increased， while IFN-γ and IFN-γ/IL-4 were significantly decreased in the post-ROSC group compared with the sham-operated group （P<0，05） at 2-12 h after ROSC. Protein level and expression of GATA-3 mRNA in lung tissue were markedly increased， while those of T-bet were significantly reduced in the post-ROSC group compared with the sham-operated group （P<0，05） at 12 and 24 h after ROSC.Conclusions The lung immune dysfunction induced by imbalance between transcription factors GATA-3 mRNA and T-bet mRNA expressions may complicate in the process of post-resuscitation lung injury in a porcine model of cardiac arrest.

【Key words】Cardiopulmonary resuscitation；Acute lung injury；Th1/Th2 imbalance； Immune dysfunction；GATA-3；T-bet

心搏驟停后，全身性缺血導(dǎo)致各組織器官均出現(xiàn)嚴(yán)重的缺血缺氧，并伴有嚴(yán)重酸中毒，從而導(dǎo)致組織細(xì)胞的能量代謝障礙、蛋白變性、細(xì)胞損傷甚至死亡[1]。當(dāng)炎性反應(yīng)過度，炎癥介質(zhì)產(chǎn)生異常，機(jī)體反應(yīng)過激、失控，這種過度的全身炎癥反應(yīng)可累及到肺引起急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[2]，進(jìn)而發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征[3]。目前考慮心肺復(fù)蘇（CPR）后的ALI主要與氧自由基、缺血-再灌注和凋亡等有一定的關(guān)系[4-6]。

輔助性T細(xì)胞主要有T淋巴細(xì)胞亞群l和2（Thl/Th2），Th1細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素、IL-12和腫瘤壞死因子β；Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子。前者與細(xì)胞免疫相關(guān)，而后者則參與體液免疫。在正常情況下，機(jī)體Thl/Th2細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持機(jī)體正常的免疫功能[7]。轉(zhuǎn)錄因子T-bet是Thl細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子，參與Thl的分化和轉(zhuǎn)化。而GATA-3則在Th2細(xì)胞分化過程中起關(guān)鍵作用，它是所有Th2型細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄所必需的，因而轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3最終決定了Thl與Th2的分化方向。心搏驟停一旦發(fā)生，可理解成一種超常的應(yīng)激反應(yīng)，必將引起轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3的失衡，從而導(dǎo)致Th1/Th2 的失衡， 出現(xiàn)Th2 型細(xì)胞因子發(fā)生瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)， 引發(fā)和促進(jìn)ARDS及多器官功能衰竭[8]。目前，有關(guān)T-bet和GATA-3的失衡進(jìn)一步導(dǎo)致的肺免疫功能障礙在CPR后ALI中的作用在國(guó)內(nèi)外并沒有報(bào)道。

本研究主要是建立小型豬室顫8 min模型，復(fù)蘇成功后通過檢測(cè)小型豬的血清中IL-4、TNF-α和INF-γ的水平和肺組織的T-bet和GATA-3蛋白表達(dá)以及mRNA水平，從而證實(shí)心肺復(fù)蘇后肺組織細(xì)胞出現(xiàn)由轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和T-bet介導(dǎo)的Th1/ Th2 失衡導(dǎo)致的免疫功能障礙，其機(jī)制可能是導(dǎo)致復(fù)蘇后ALI的主要機(jī)制之一。

1 材料與方法

1，1 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

GATA-3抗體購自ab113519； Abcam Biotechnology， UK；T-bet抗體購自sc-21003； Santa Cruz Biotechnology， USA。FITC 標(biāo)記的CD8單克隆抗體（Mouse anti pig，IgG1）、PE/cy5標(biāo)記的CD4單克隆抗體（Mouse anti pig，IgG2b）購自尚柏生物技術(shù)有限公司，IL-4（6R019），TNF-α（6R071）和INF-γ（6R082）試劑購自Santa Cruz 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購自杭州博日科技有限公司，Q-CPRTMHeartStart MRx監(jiān)護(hù)儀/除顫器（荷蘭飛利浦醫(yī)療系統(tǒng)公司提供），GY-600A醫(yī)用程控刺激儀購自中國(guó)開封華南儀器有限公司，HP M1165多功能監(jiān)測(cè)儀（美國(guó)惠普公司提供），Line-gene 熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（杭州博日科技有限公司提供）。

1，2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)用近交系五指山小型豬（WZSP Inbred s Minipig）26頭，雄性，月齡為10～12個(gè)月，體質(zhì)量為（30±2）kg，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為假手術(shù)組（6頭），復(fù)蘇12 h組（10頭）和復(fù)蘇24 h組（10頭）。

1，3 室顫動(dòng)物模型的制備

術(shù)前晚上禁食，自由飲水。肌注氯胺酮（0，5 mg/kg），聯(lián)合耳緣靜脈注射丙泊酚2 mg/kg誘導(dǎo)麻醉，瑞芬太尼注射液首劑0，25 mg靜脈推注，以后以30～50 μg/（kg·h）連續(xù)靜脈滴注以鎮(zhèn)痛。麻醉維持階段，首劑使用3%戊巴比妥鈉30 mg/（kg·h）靜脈推注，以后以8 mg/（kg·h）靜脈推注。氣管切開后置入直徑6，5 F的氣管插管，連接CO₂SMOplus呼吸監(jiān)護(hù)儀及呼吸機(jī)，吸入氧體積分?jǐn)?shù)為21%，通氣頻率為12次/min，潮氣量設(shè)為15 mL/kg，然后調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)，使呼吸末PCO₂保持在35～40 mmHg（1 mmHg=0，133 kPa）。備皮后連接心電監(jiān)護(hù)，監(jiān)測(cè)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。將一個(gè)直徑7F的血管造影用鞘管置入右側(cè)股靜脈，并放置雙極臨時(shí)起搏電極直至右心室[9]。

將心室內(nèi)電極導(dǎo)線外接醫(yī)用程控刺激儀GY-600A，選擇食道輸出S1S2（300/200 ms）模式，8∶ 1比例，步長(zhǎng)-10 ms連續(xù)電刺激，直到出現(xiàn)室顫。室顫的判斷標(biāo)準(zhǔn)是動(dòng)脈血壓迅速下降，心電圖顯示VF波形[10]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組：12 h復(fù)蘇組（10頭）和24 h復(fù)蘇組（10頭）：人工心外按壓頻率為100次/min，每30次按壓后暫停5 s，使用空氣以人工氣囊進(jìn)行通氣2次，TV 300 mL，即6次/min。使用Q-CPRTM技術(shù)監(jiān)測(cè)CPR質(zhì)量，先按壓2 min，如果沒有ROSC，則開始電擊除顫，除顫能量為150 J（雙相指數(shù)截?cái)嗖ǎ绻麤]有ROSC，進(jìn)行下一次復(fù)蘇周期，在試驗(yàn)中不使用任何復(fù)蘇藥物；假手術(shù)組（SHAM）（6頭）：進(jìn)行同樣的步驟包括麻醉，呼吸機(jī)輔助通氣和導(dǎo)管的留置，但不除顫不按壓。ROSC后給予持續(xù)呼吸機(jī)機(jī)械通氣，分別在復(fù)蘇前，后即刻，0，5、2、6 h留取動(dòng)脈血；在復(fù)蘇前，復(fù)蘇后0，5、2、6、12、24 h留取靜脈血。ROSC后復(fù)蘇兩組分別在12、24 h將動(dòng)物注射過量氯化鉀處死。將豬左側(cè)頸外靜脈剪開，經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插管勻速灌注生理鹽水至血液變清，開胸取肺，左右肺離斷，取右肺中葉分別置于10%中性緩沖福爾馬林中固定和-80 ℃液氮保存。

ROSC標(biāo)準(zhǔn)：主動(dòng)脈收縮壓在50 mmHg以上，并且持續(xù)時(shí)間超過10 min；如果30 min未達(dá)到ROSC，則認(rèn)為復(fù)蘇失敗，動(dòng)物死亡[11]。

1，4 血?dú)夥治龊徒M織學(xué)

檢測(cè)復(fù)蘇前，復(fù)蘇后0、0，5、2、6 h的動(dòng)脈血?dú)夥治?。肺組織標(biāo)本常規(guī)切片，分別在光鏡和透射電鏡HITACHI H-7650型（北京神經(jīng)外科研究所電鏡室）下觀察。

1，5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺淋巴細(xì)胞亞群的分布

分別取復(fù)蘇后12 h和24 h的抗凝血4 mL，在6 h之內(nèi)分離PBL，取至少2×10⁶個(gè)PBL 加入1，5 mL離心管中，用1 mL 熒光洗液（含2% NBS的0，15 mol/L PBS，pH 7，4）洗滌2次，洗滌時(shí)1000 r/min 離心5 min，棄上清液，用200 μL熒光洗液重懸細(xì)胞。將每個(gè)樣品的PBL進(jìn)行CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)：向每個(gè)樣品的其中一管細(xì)胞中加入FITC 標(biāo)記的CD3 單抗2 μL和PE/cy5 標(biāo)記的CD4和CD8單抗2 μL，混勻后4 ℃避光放置30 min，用1 mL熒光洗液洗滌2次，管底細(xì)胞用500 μL 熒光保存液（含2%葡萄糖、1%甲醛和0，1% NaN3的0，15 mol/L PBS，pH 7，4）重懸，分析至少5000個(gè)單個(gè)核細(xì)胞群，確定CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺的百分比，計(jì)算CD4⁺/CD8⁺。

1，6 ELISA 法檢測(cè)血清IL-4、TNF-α 和INF-γ的濃度

取2 mL靜脈血，3000 r/min高速離心，取血清25 μL加入相應(yīng)的樣品孔中，每孔加入25 μL Biotin Anti 豬IL-4、TNF-α 和INF-γ，輕輕混勻30 s，室溫溫育0，5 h，洗板，每孔加入50 μL HRP，再次輕輕混勻30 s，室溫溫育30 min，再次洗板，每孔加入50 μL顯色液，輕輕混勻10 s，室溫溫育15 min，每孔加入50 μL終止液，輕輕混勻30 s，30 min內(nèi)在450 nm處讀吸光度A值，根據(jù)吸光度A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出細(xì)胞因子的濃度。

1，7 Western-blot法檢測(cè)肺組織 GATA-3和T-bet的蛋白表達(dá)

配12%分離膠，并用dd H₂O封膠，配 4%的濃縮膠灌膠，開始電泳。濃縮膠電泳電壓為80 V，分離膠電泳電壓為120 V。轉(zhuǎn)膜完畢后用TBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫放置4 h。用1%的封閉液將一抗GATA-3和T-bet分別按1∶ 200和1∶ 500稀釋，將膜與一抗一起孵育，4 ℃過夜。二抗孵育結(jié)束，TBS-T洗3次，每次5 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液，將顯色后的膜或底片照相，并用LabWorks軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

1，8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肺組織GATA-3和T-bet mRNA水平

利用Primer express 3，0軟件及oligo 6等生物軟件分析。按GATA-3和T-bet基因序列設(shè)計(jì)并合成引物，引物序列為：T-bet（118 bp）：上游引物：5 -ACAAACCCGATATGGCTGA- GA-3 ，下游引物：5 -CCTGCTTGCTTCTCCTGTTC-3 ，GATA-3（240 bp）：上游引物5 -T- GCGGGCTCTACCACAA

AAT-3 ，下游引物：5 -TCGGTTTCTGGTCTGGAT

GC-3 ，GAPDH：上游引物：5 -CCATCACTGCC

ACTCAGAAGACT-3 ，下游引物：5 - GTCAGATC

CACAACGGATACATTG -3 。反應(yīng)體系： Mix 5 μL， cDNA 2 μL，上/下游引物（10 pmol/L）1 μL，2XSYBR Mix （with 4 mmol Mg2+） 25 μL，反應(yīng)總體積為10 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性20 s， 65 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，60 ℃延伸結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)，并作溶解曲線檢測(cè)引物特異性。將各樣本Ct值代入公式基因表達(dá)量 = 2-ΔΔCt計(jì)算，其中ΔΔCt = [目的基因的平均Ct值（樣本組）-管家基因的平均Ct值（樣本組）]-[目的基因的平均Ct值（校正組）-管家基因的平均Ct值（校正組）]。

1，9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17，0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理， 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組均數(shù)比較用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)和相關(guān)性分析，以P<0，05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

復(fù)蘇12 h組和24 h組分別各有2頭動(dòng)物復(fù)蘇失敗死亡，死亡的4頭動(dòng)物被排除而不納入統(tǒng)計(jì)分析。

2，1 動(dòng)脈血?dú)夥治?/p>

SHAM組和CPR組的血?dú)夥治鲋笜?biāo)在心搏驟停前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。復(fù)蘇后各時(shí)相組pH值較SHAM組明顯降低（P<0，05），而PaCO₂雖然較SHAM組有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0，05），在復(fù)蘇后即刻和0，5 h，CPR組PaO2較SHAM組明顯降低（P<0，05），復(fù)蘇后其余各時(shí)相組與SHAM組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2，2 組織形態(tài)學(xué)

光鏡下SHAM組無明顯病理改變（圖1A）；CPR組光鏡下可見肺泡腔狹窄，肺泡壁增厚，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺泡內(nèi)有明顯出血，并有水腫液滲出，肺泡腔內(nèi)有脫落上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（ 圖1B）。電鏡顯示，SHAM組肺內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞無腫脹，上皮細(xì)胞完整（ 圖1C）；CPR組肺內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，上皮細(xì)胞壞死崩解（圖1D）。

2，3 CD3⁺、CD4⁺淋巴細(xì)胞亞群的分布

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，在復(fù)蘇后的12 h和24 h，豬PBL中CD3⁺細(xì)胞（32，8±4，1）%， （21，1±5，7）%和CD4⁺細(xì)胞的比例（28，4±2，3）%， （24，1±1，6）%分別明顯低于SHAM組（65，2±8，5）%， （63，9±9，1）%和（48，4±2，9）%， （51，1±5，4）%， CD4⁺/CD8⁺（1，7±0，9）， （1，5±1，0）也較SHAM組降低（2，5±1，3）， （2，7±1，1） （P<0，05）。見表2。

2，4 血清IL-4a、TNF-α和INF-γ的水平

如圖2所示，與SHAM組比較，CPR組的IL-4水平在2 h開始明顯升高，隨復(fù)蘇后時(shí)間的延長(zhǎng)而呈增加趨勢(shì)，在12 h達(dá)到高峰，在24 h開始下降；而INF-γ水平則在2 h開始明顯降低，在12 h達(dá)到最低，并且INF-γ/IL-4 比值也在2 h開始明顯下降。此外，TNF-α水平則在復(fù)蘇后0，5 h就開始明顯升高，在2 h達(dá)到高峰，然后逐漸降低。

2，5 肺組織GATA-3和T-bet的蛋白表達(dá)

CPR組（12 h和24 h組）和SHAM組的肺組織GATA-3蛋白表達(dá)分別是0，52±0，07，0，69±0，04和0，29±0，06，CPR組比SHAM組明顯增加；而T-bet的蛋白表達(dá)分別是0，30±0，02，0，16±0，04和0，47±0，09，CPR組比SHAM組明顯減少（圖3）。

2，6 肺組織GATA-3和T-bet的mRNA水平

CPR組的肺組織GATA-3的mRNA水平在分別為2，54±0，13， 3，42±0，15和0，81±0，06，較SHAM組明顯升高，而T-bet的mRNA水平分別為0，56±0，05， 0，29±0，15和0，91±0，04，較SHAM組明顯減低（圖4）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在復(fù)蘇后的早期（6 h內(nèi)），單從血?dú)夥治鰜砜?，CPR組的小豬短期內(nèi)肺功能似乎改變并不嚴(yán)重，但在光鏡和電鏡下觀察較SHAM組不論是肺臟的組織結(jié)構(gòu)還是細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)都有著較為明顯的損傷。復(fù)蘇后肺組織細(xì)胞的病理改變不僅可見肺組織細(xì)胞的水腫、滲血，同時(shí)也可見I型肺泡上皮和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞及肺泡隔等功能性結(jié)構(gòu)的損傷。這主要是由于在自主循環(huán)恢復(fù)以后，缺血后代謝產(chǎn)物使微血管通透性增加、液體外滲、血小板聚集、阻滯微循環(huán)導(dǎo)致血流分布異常、組織缺血-再灌注損傷、血管收縮和舒張異常， 導(dǎo)致血管擴(kuò)張， 加劇液體外滲， 血流分布紊亂， 引起肺灌注失常，肺表面活性物質(zhì)減少，毛細(xì)血管通透性增加，血漿蛋白滲出，進(jìn)而導(dǎo)致急性肺損傷[12]。

T細(xì)胞亞群CD4⁺、CD8⁺均是T細(xì)胞重要的表面抗原標(biāo)志，作為免疫效應(yīng)細(xì)胞在直接殺傷靶細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的功能。CD4⁺細(xì)胞為輔助T淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞免疫的效應(yīng)階段和變態(tài)反應(yīng)中能產(chǎn)生多種淋巴因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，從而加速消除抗原物質(zhì)。CD8⁺細(xì)胞可對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，對(duì)CD4⁺細(xì)胞具有調(diào)節(jié)性抑制作用，CD4⁺/CD8⁺比值可反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，CD4⁺/CD8⁺比值降低反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能的抑制[13]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，CPR組的CD4⁺細(xì)胞亞群和CD4⁺/CD8⁺比值都較SHAM組明顯降低，這可能與抗炎細(xì)胞因子的升高，抑制淋巴細(xì)胞的增殖以及誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞發(fā)生FAS和FAS-L的結(jié)合，通過Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞彼此殺傷或直接“自殺”，使T細(xì)胞總數(shù)和活化的T細(xì)胞數(shù)量下降[14]。這反映在心肺復(fù)蘇后機(jī)體存在嚴(yán)重的免疫失調(diào)和抑制，這種過度的免疫失調(diào)和全身炎癥反應(yīng)往往可造成多器官功能障礙，而肺往往是最先受累的器官。

Thl/Th2分化失衡涉及多種疾病，如腫瘤、自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病、內(nèi)分泌疾病、感染性疾病、移植排斥反應(yīng)等。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNF-α在CPR后0，5 h即大量出現(xiàn)，并持續(xù)升高，2～4 h達(dá)高峰，6 h有所下降，但仍在較高水平。這說明在CPR后，機(jī)體啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，ROSC后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可引起促炎、抗炎反應(yīng)失去平衡，導(dǎo)致Thl細(xì)胞因子（INF-γ）表達(dá)降低及Th2細(xì)胞因子（IL-4）表達(dá)上升。INF-γ主要促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，抑制Th2細(xì)胞增殖；IL-4主要促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，抑制Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，繼而引起Th1向Th2大量分化，促成了Th細(xì)胞向Th2方向極化，從而導(dǎo)致Th1和Th2的失衡[15]，引起免疫抑制，可進(jìn)一步發(fā)展為免疫失調(diào)[7]，導(dǎo)致發(fā)生MODS。筆者認(rèn)為復(fù)蘇后的早期，機(jī)體經(jīng)歷了缺血-再灌注過程。復(fù)蘇后全身各臟器的再灌注損傷產(chǎn)生大量氧自由基、乳酸、花生四烯酸的代謝產(chǎn)物等炎性介質(zhì)，隨血流到達(dá)肺組織細(xì)胞，從而造成再灌注損傷，這些炎性細(xì)胞因子相互影響，進(jìn)一步引起炎癥反應(yīng)失控，加重肺組織的免疫功能障礙。

GATA-3是屬于GATA轉(zhuǎn)錄因子家族的一種細(xì)胞譜系特異性因子，是Th2細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，參與幾乎所有Th2類細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄；并且在Th2類細(xì)胞因子的基因的啟動(dòng)子區(qū)存在GATA-3的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)Th2細(xì)胞的分化起主導(dǎo)作用[16]。而T-bet 則是屬于T-box家族的一種新型轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)Th0向Th1發(fā)育、正調(diào)控Th1類細(xì)胞因子的表達(dá)，它的主要作用是抑制GATA-3表達(dá)，進(jìn)而阻止Th1細(xì)胞向Th2分化[17，18]。此外，T-bet也是INF-γ基因強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄激活劑。T-bet和GATA-3的共同作用引起Th1/Th2兩類細(xì)胞因子在表達(dá)水平上的差異，是決定Thl/Th2極性分化的決定性因素，而且兩者具有交互抑制作用，T-bet正調(diào)節(jié)Thl型細(xì)胞因子。GATA-3正調(diào)節(jié)Th2型細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小型豬CPR組的肺組織GATA-3和T-bet的蛋白表達(dá)和mRNA水平均較SHAM組分別有著明顯的升高和降低，GATA-3的高表達(dá)和T-bet的低表達(dá)，會(huì)誘導(dǎo)IL-4的升高和INF-γ的降低，從而使Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞的漂移，引起機(jī)體的免疫失衡，進(jìn)一步引發(fā)的MODS可能是導(dǎo)致復(fù)蘇后肺組織細(xì)胞損傷的首要因素。因此在ROSC后，既可能存在免疫亢進(jìn)，也可能存在免疫抑制，兩者可同時(shí)存在，其強(qiáng)弱也處于不斷變化之中，機(jī)體處于一種復(fù)雜的免疫紊亂和失衡狀態(tài)。因此，相應(yīng)的免疫治療也不應(yīng)只強(qiáng)調(diào)抑制炎癥反應(yīng)這一個(gè)方面，而在于重建患者的免疫平衡穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，在心肺復(fù)蘇后的早期，CPR組小豬的肺組織細(xì)胞受到了明顯的損傷，同時(shí)出現(xiàn)肺組織轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的上調(diào)和T-bet的下調(diào)，進(jìn)一步引起了Th1和Th2類細(xì)胞因子的失衡，導(dǎo)致肺組織的免疫功能的抑制，這可能是導(dǎo)致心肺復(fù)蘇后急性肺損傷的機(jī)制之一。

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（收稿日期：2013-05-11）

（本文編輯：鄭辛甜）

DOI：10，3760/cma，j，issn，1671-0282，2014，01，004

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（30972863）；2012北京市優(yōu)秀博士學(xué)位論文專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2012-1002501）

作者單位：100020 北京，首都醫(yī)科大學(xué)北京朝陽醫(yī)院急診科

通信作者：李春盛，Email：banditgu@hotmail，com

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