張文琪 郝 權

術前外周血NLR對上皮性卵巢癌患者預后的影響

張文琪 郝 權

目的：評價術前外周血中性粒細胞/淋巴細胞比值（neutrophit-to-lymphocyte ratio，NLR），對上皮性卵巢癌患者預后的預測意義。方法：回顧性分析天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院80例上皮性卵巢癌患者的臨床病理資料，通過建立受試者工作特征曲線（ROC曲線），確定術前外周血NLR預測術后生存的最佳截點，以此將患者分為低NLR和高NLR兩組，分析NLR與患者的臨床病理特征之間的關系，并通過單因素及多因素分析評估術前外周血NLR對患者術后生存的影響。通過免疫組織化學法驗證術前NLR與腫瘤相關巨噬細胞浸潤的關系。結(jié)果：術前NLR預測患者術后生存時間的最佳截點為3.8。術前低NLR組（NLR≤3.8）與高NLR組（NLR＞3.8）患者在FIGO分期的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.005），而在其他的各項臨床病理特征間差異均無統(tǒng)計學意義。80例上皮性卵巢癌術后中位生存時間為45個月，術后1、3年生存率分別為93.7%、60.0%。單因素分析結(jié)果顯示：術前NLR＞3.8（P＜0.005）及術后FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期（P＜0.005）是影響患者術后總體生存以及無瘤生存期的危險因素。多因素分析顯示：術前NLR＞3.8（P＜0.05）及術后FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期（P＜0.05）為上皮性卵巢癌患者術后預后不良的獨立危險因素。免疫組織化學法表明腫瘤相關巨噬細胞在術前高NLR組54.65±8.78與低NLR組41.78±9.10之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。結(jié)論：術前NLR升高提示患者預后不良，是影響上皮性卵巢癌患者預后的獨立危險因素。

卵巢癌 中性粒細胞/淋巴細胞比值 預后 總體生存時間 腫瘤相關巨噬細胞

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病隱匿，早期癥狀不典型以及缺乏早期診斷方法，大部分發(fā)現(xiàn)時已是晚期。晚期卵巢癌惡性程度高，預后差，病死率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首，因此，卵巢癌的早期診斷及早期治療具有極其重要的意義。越來越多的研究表明，腫瘤相關炎癥是影響腫瘤患者預后的重要因素。作為反映全身炎癥反應的評價指標之一，中性粒細胞/淋巴細胞比值（neutro-phil-to-lymphocyte ratio，NLR）已被證實是結(jié)直腸癌、乳腺癌、軟組織肉瘤等多種惡性腫瘤患者的獨立預后因素之一［1-5］。但目前升高的NLR對于上皮性卵巢癌患者預后影響的研究不多。本研究系統(tǒng)性的回顧性了80例上皮性卵巢癌患者的臨床病理資料，探討術前NLR值對患者術后生存的影響及預測意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2007年1月至2009年1月于天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院行上皮性卵巢癌手術患者80例納入該回顧性研究，患者年齡（27～83）歲，平均年齡為55.4歲。收集患者的其他資料包括年齡、術前CA125水平、術前1周內(nèi)血常規(guī)化驗結(jié)果，術后病理資料包括腫瘤大小、病理類型、分化程度、術后FIGO分期等資料。腫瘤的組織類型由病理醫(yī)師根據(jù)WHO分類進行評估，而腫瘤術后FIGO分期則根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2010年修訂的FIGO分期標準，由婦科腫瘤?？漆t(yī)生、術者術中以及病理醫(yī)生術后進行多學科評估。

1.2 方法

1.2.1 病例排除標準 術前1周內(nèi)無血常規(guī)資料；術前有急/慢性感染或嚴重出血證據(jù)；伴有血液系統(tǒng)惡性腫瘤；圍手術期因手術并發(fā)癥死亡，如感染性休克。1.2.2 隨訪情況 術后隨訪內(nèi)容包括病史收集、全身體格檢查及盆腔檢查、腫瘤標記物、盆腹腔超聲、CT，每2～4個月進行1次，持續(xù)2年。后3年每3～6個月1次，5年后每年1次。總生存時間（OS）定義為從手術日期至死亡或隨訪結(jié)束日。復發(fā)的診斷以影像學檢查（B超、CT、MRI、PET-CT等）發(fā)現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶為準，單純的CA125升高不作為復發(fā)時間出現(xiàn)的標準。DFS定義為從手術日期至確診復發(fā)日期之間月數(shù)。

1.2.3 免疫組織化學法 80例上皮性卵巢癌標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，4 μm切片。組織脫蠟至水，高壓修復2.5 min（修復液為pH6.0、濃度為10 mmol/L枸櫞酸鹽溶液），冷卻至室溫。3%過氧化氫室溫封閉內(nèi)源性過氧化氫酶20 min。PBS洗滌3次后，加入抗CD68（1：300稀釋，Abcam，Cambridge，MA，USA）一抗，4℃孵育過夜。二抗37℃孵育30 min；DAB顯色；蘇木精復染、脫水、透明，中性樹膠封片。結(jié)果判斷：采用盲法（即統(tǒng)計人員不清楚患者的臨床病理參數(shù)）對結(jié)果進行判定。于1物鏡（×100）下選取5個“熱點”區(qū)域，然后在物鏡（×400）下計數(shù)CD68陽性細胞、取平均值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。ROC曲線法確定NLR的臨界值，對服從正態(tài)分布的計量資料，用（均值±標準差）進行描述，對非正態(tài)分布的連續(xù)性資料，采用中位數(shù)（極差）進行描述。計數(shù)資料采用χ2和Fisher's確切概率法進行各組間的比較。生存分析中生存率的計算采用Kaplan-Meier法，組間生存率比較采用Log-rank檢驗，Cox比例風險模型分析檢驗影響預后的獨立因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況

80例患者術后病理類型：卵巢漿液性囊腺癌42例，黏液性囊腺癌5例，宮內(nèi)膜樣腺癌26例，透明細胞癌7例；FIGO分期：Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期53例。中位隨訪時間為45（1～67）個月。所有患者中，47例為盆腔內(nèi)復發(fā)和（或）轉(zhuǎn)移病灶。術后1、3年生存率分別為93.7%、60.0%。

2.2 NLR最佳截點的確定

80例患者術前外周血NLR為3.72±2.46。根據(jù)ROC曲線（圖1），當NLR為3.8時，約登指數(shù)最大為0.488，故取3.8作為NLR的最佳截點，其評估本組患者術后生存情況的敏感度為66.7%，特異度為82.1%，曲線下面積為0.771。以3.8為截點，術前NLR＞3.8者26例，占32.5%。

圖1 確定術前NLR最佳截點的ROC曲線Figure 1 Identification of the best cut-off value of preoperative NLR with ROC curve

2.3 NLR與患者臨床病理特征的關系

術前低NLR組與高NLR組相比，在術后FIGO分期上的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.005），而在其他臨床病理特征之間差異均無統(tǒng)計學意義（表1）。

2.4 影響術后無瘤生存期和總體生存期的單因素分析

Log-rank單因素分析顯示，術前NLR＞3.8以及術后FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期是影響上皮性卵巢癌患者術后無瘤生存期以及總生存時間的危險因素（表2，圖2～3）。

2.5 影響術后無瘤生存期和總體生存期的多因素分析

將影響上皮性卵巢癌患者術后無瘤生存期以及總生存時間的危險因素中術前NLR＞3.8以及術后FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期調(diào)入Cox比例風險模型，結(jié)果顯示，NLR＞3.8以及術后FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期是預測患者術后總體生存時間的獨立危險因素（表3）。

表1 80例上皮性卵巢癌患者術前低NLR組與高NLR組的臨床病理特征Table 1 Clinicopathological characteristics of 80 patients with EOC with low or high NLR at surgery

表2 80例上皮性卵巢癌患者術后總體生存與無瘤生存期影響因素的單因素分析Table 2 Univariate analysis of the factors affecting the survival of 80 patients with EOC after surgery

圖2 低NLR組與高NLR組患者PFS曲線Figure 2 Comparison of the PFS curves of cases with low and high NLR

2.6 術前NLR與腫瘤相關巨噬細胞表達的關系

腫瘤相關巨噬細胞大部分位于癌旁間質(zhì)（圖4A～B）。腫瘤相關巨噬細胞在術前高NLR組為54.65±8.78與低NLR組為41.78±9.10之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖4C）。

圖3 低NLR組與高NLR組患者OS曲線Figure 3 Comparison of the OS curves of the cases with low and high NLR

表3 80例上皮性卵巢癌患者術后生存影響因素的Cox多因素分析Table 3 Multivariate Cox-proportional hazard regression analysis of the prognostic factors for survival of 80 patients with EOC after surgery

A：Expressions of TAMs in ovarian tissues from cases with low NLR；B：Expressions of TAMs in ovarian tissues from cases with high NLR；C：Number of TAMs differed significantly between low and high NLR groups（*P＜0.001）

3 討論

卵巢癌是婦科最常見的三大惡性腫瘤之一，其復雜的腫瘤微環(huán)境是影響卵巢癌預后的重要因素之一。越來越多的研究證實，慢性炎癥在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。炎癥導致細胞損傷、氧化應激、前列腺素的升高，進而導致基因突變（如p53基因）發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。像Balkwill［6］等所形容的那樣，如果基因損傷點燃了腫瘤形成的火花，那隨之而來的炎癥反應就像不斷供給的燃料。近年來，許多研究關注了能夠反映系統(tǒng)性炎癥反應的臨床常用指標，如C-反應蛋白、白蛋白，以及基于這些指標的GPS評分，并在對患者進行分層治療以及預測腫瘤患者的預后方面有重要的指導意義。已經(jīng)有研究證實，升高的CRP是原發(fā)直腸癌行直腸癌根治術患者術后獨立的預后因素［7］。但是，卵巢癌患者一般不常規(guī)檢測C-反應蛋白，相比而言，用外周血白細胞計數(shù)來反映和檢測腫瘤患者系統(tǒng)性炎癥反應程度比其他指標更簡便易行且具有實際意義［8］。因此，常用中性粒細胞計數(shù)及淋巴細胞計數(shù)的比值來反映腫瘤患者系統(tǒng)性炎癥反應。

目前，國內(nèi)外有關NLR對卵巢癌患者術后生存預測的研究相對較少。Cha等［9］對比了卵巢良、惡性疾病中不同白細胞種類的表達以及NLR對患者生存的影響，指出聯(lián)合術前外周血中NLR與CA125水平能夠提高早期卵巢癌的檢出率，從而有利于卵巢癌的早期診斷早期治療。該研究還指出，NLR是影響卵巢癌患者術后復發(fā)以及總體生存的獨立危險因素，無論是在單因素分析中還是多因素分析中都具有重要的預測意義。除此之外，Thavaramara等［10］進一步指出，相比于總體生存時間，術前NLR能夠更好地預測上皮性卵巢癌患者術后的無瘤生存期。

本研究中，運用ROC曲線法確定術前NLR預測術后生存的最佳截點為3.8，曲線下面積為0.771，說明該指標對術后生存有較好的預測價值。根據(jù)最佳截點將患者分為低NLR及高NLR兩組，兩組患者的NLR在術后FIGO分期上的差異具有統(tǒng)計學意義，而其他各臨床病理特征則相似。對上皮性卵巢癌患者進行單因素分析結(jié)果顯示：術前NLR＞3.8是上皮性卵巢癌患者術后無瘤生存期以及總生存時間的危險因素，提示這部分患者機體免疫狀態(tài)不佳、腫瘤惡性程度較高，預后較差。Cox多因素分析顯示：術前NLR＞3.8以及術后FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期是預測患者術后總體生存時間的獨立危險因素。卵巢癌患者的術后生存時間不僅僅取決于FIGO分期，也受到術前NLR的影響，充分說明機體免疫系統(tǒng)在卵巢癌的免疫監(jiān)視中扮演著重要角色。基于此，本研究認為通過提高自身免疫、增強營養(yǎng)狀況或許能夠改善卵巢癌患者的預后。

NLR影響腫瘤患者預后的具體機制不甚明確，一種解釋是宿主的抗腫瘤免疫反應是淋巴細胞依賴性的，NLR升高的患者，往往伴有淋巴細胞計數(shù)相對減少，降低了其介導的抗腫瘤反應，進而形成了適合癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移的環(huán)境，導致患者預后不良；另一方面，中性粒細胞被認為是循環(huán)中血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的主要來源，VEGF的過表達促了進腫瘤血管的生成，有利于腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移。當然，NLR的增高不一定是中性粒細胞或者淋巴細胞單一比例失衡造成的，可能更重要的是扮演著一個促腫瘤炎癥反應與抗腫瘤免疫反應的平衡狀態(tài)。

腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages TAMs）是構(gòu)成腫瘤局部炎性微環(huán)境的重要組成部分［11］。TAMs來源于外周循環(huán)中的單核細胞，單核細胞的招募、分化、存活和增殖組成了TAMs形成的全過程［12］。TAMs通過上調(diào)金屬基質(zhì)蛋白酶等的活性促進腫瘤的遷徙與轉(zhuǎn)移。同時，通過介導FoxP3陽性調(diào)節(jié)性T細胞的擴增來下調(diào)機體的抗腫瘤免疫反應［13］。Motomura等［14］在探討肝細胞癌患者肝移植術后NLR升高的相關機制時曾指出，外周血中NLR的升高通常伴有IL-17水平上升及癌旁浸潤的TAMs的增加。因此，在本研究中，通過免疫組織化學法探討了在上皮性卵巢癌中術前NLR與TAMs表達的關系。結(jié)果顯示，術前NLR的升高往往也伴隨著TAMs浸潤數(shù)目的增多。這可能是因為TAMs在腫瘤局部低氧環(huán)境中分泌VEGF、CXC趨化因子12及其受體CXCR4，促進單核細胞以及中性粒細胞的招募以及通過介導FoxP3陽性調(diào)節(jié)性T細胞的擴增下調(diào)機體的抗腫瘤免疫反應。

另外，學術界對采用血清CA125水平來預測卵巢癌患者術后生存尚存在爭議。Paramasivam等［15］曾報道術前血清CA125＞30 U/mL為I期卵巢癌患者術后的獨立預后因素（HR=2.40，95%CI：1.26～4.59，P= 0.028），但是在本研究中，Cox多因素分析顯示術前CA125水平不能作為患者預后的獨立危險因素。這可能是由于腫瘤的病理類型、分化程度以及腫瘤自身特征不同所導致的。

總之，NLR作為一種新的卵巢癌血清生物學指標，具有簡單方便、快捷經(jīng)濟的優(yōu)點，但是在利用NLR評估預后時不能僅憑此單一指標，應結(jié)合多種指標進行綜合分析。由于目前國內(nèi)外該類研究較少，因此術前外周血NLR測定對卵巢癌預后的預測價值及參考值，尚需多中心、大樣本量的臨床證實。

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7 Gunter MJ,Stolzenberg-Solomon R,Cross AJ,et al.A prospective study of serum C-reactive protein and colorectal cancer risk in men [J].Cancer Res,2006,66(4):2483-2487.

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9 Chao H,Hur HW,Kim SW,et al.Pre-treatment neutrophil to lymphocyte ratio is elevated in epithelial ovarian cancer and predicts survival after treatment[J].Cancer Immunol Immunother, 2009,58(1):15-23.

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（2013-06-04收稿）（2013-10-24修回）

Preoperative blood neutrophil to lymphocyte ratio as an independent prognostic predictor for epithelial ovarian cancer

Quan HAO;E-mail:haoquandoctor@163.com

Department of Gynecologic Oncology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin,Tianjin 300060,China

Objective:This study aims to evaluate the effect of an elevated preoperative neutrophil to lymphocyte ratio(NLR)on outcome after comprehensive staging laparotomy or optimal tumor debulking surgery for epithelial ovarian cancer(EOC)and determine the value of the NLR as an independent prognostic prediction marker.Methods:A total of 80 women with primary EOC and with complete clinical and pathological information documented at the time of surgery were selected for this study.The optimum cut-off value of the preoperative NLR was identified through receiver operator characteristic(ROC)curve,and the patients were then classified into two groups:low and high NLR group.Univariate and multivariate analyses were performed to assess the prognostic effect of the preoperative NLR patients who underwent comprehensive staging laparotomy or optimal tumor debulking surgery.The levels of expression of CD68 were measured through immunohistochemistry.Results:The optimal cut-off value of the NLR was 3.8. The preoperative NLR differed significantly in the FIGO stage between the low NLR group(NLR≤3.8)and the high NLR group (NLR>3.8),but no discrimination was observed in other parameters.The mean follow-up time was 45 months,and the post-operative 1-and 3-year survival rates were 93.7%and 60.0%,respectively.The preoperative NLR>3.8 and stageⅢ/Ⅳwere all risk factors for poor overall and disease-free survival.Multivariate analysis revealed the patients with high NLR(P<0.05)and stageⅢ/Ⅳ(P<0.05) had prognostic significance for poor overall survival.The number of CD68-positive tumor-associated macrophages was significantly higher in the high NLR group than in the low NLR group(54.65±8.78 and 41.78±9.10,respectively;P<0.001).Conclusion:An elevated blood preoperative NLR indicates poor prognosis in patients with EOC.Preoperative NLR may function as an important independent prognostic factor for patients with EOC.

ovarian cancer,neutrophil to lymphocyte ratio,prognosis,overall survival,tumor-associated macrophages

10.3969/j.issn.1000-8179.20130874

天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院婦科腫瘤科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）

郝權 haoquandoctor@163.com

Wenqi ZHANG,Quan HAO

楊紅欣）

張文琪 碩士研究生。研究方向為婦科良、惡性腫瘤的臨床診治與研究。

E-mail：wenqi zhang 2008@126.com

·臨床研究與應用·