門 蒙 亓建洪

(泰山醫(yī)學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，山東 泰安 271000)

目前多種治療方法運(yùn)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)，但大多數(shù)療效不理想，修復(fù)組織也以纖維軟骨為多，缺乏正常透明軟骨的生物力學(xué)性能及耐用性。 同種異體骨軟骨移植術(shù)是將供體關(guān)節(jié)的活性骨軟骨塊移植到受體關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨缺損區(qū)，以修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷〔1,2〕?；颊哕浌侨睋p區(qū)完全被透明軟骨修復(fù)；關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞完全包埋在周圍軟骨基質(zhì)中，為“免疫豁免”組織。關(guān)節(jié)軟骨是一種特殊的結(jié)締組織，表面光滑位于骨兩端關(guān)節(jié)面位置，在骨與骨間的關(guān)節(jié)處為其活動(dòng)提供低磨損和摩擦的光滑界面，起著緩沖運(yùn)動(dòng)震蕩，傳遞載荷等不可替代的作用。關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)無(wú)血管、淋巴管及神經(jīng)組織，組織代謝活性較低，營(yíng)養(yǎng)全部來(lái)自關(guān)節(jié)液，基本無(wú)自身修復(fù)能力〔1,2〕。異體軟骨移植材料來(lái)源充足，不需要二次手術(shù)獲取移植物而受到患者歡迎。盡管同種異體軟骨是目前治療軟骨缺損較有效的治療手段，但實(shí)際操作過(guò)程中仍存在一些問(wèn)題。同種異體骨軟骨移植中重要的問(wèn)題是移植物的保存。體外保持軟骨細(xì)胞正常活性，延緩細(xì)胞凋亡，促使其分泌軟骨基質(zhì)，保持軟骨組織正?；钚约靶螒B(tài)。因此,延長(zhǎng)移植物的保存時(shí)間是同種異體軟骨移植的關(guān)鍵。目前，體外培養(yǎng)保存活性關(guān)節(jié)軟骨組織的最長(zhǎng)時(shí)間為3 w，遠(yuǎn)不能滿足臨床需要。限制軟骨體外保存的主要因素：化學(xué)因素及物理因素?；瘜W(xué)因素包括溫度、pH值、CO2、保存液成分。物理因素主要為力學(xué)環(huán)境。軟骨體外保存均為靜態(tài)液體保存，缺少物理因素干預(yù)。如何在體外構(gòu)建模擬人體的力學(xué)環(huán)境，延緩體外保存軟骨細(xì)胞的凋亡率，保持軟骨細(xì)胞生物活性從而延長(zhǎng)保存時(shí)間是研究探索的重點(diǎn)。

1 關(guān)節(jié)軟骨體外力學(xué)環(huán)境

成人關(guān)節(jié)骨軟骨自關(guān)節(jié)面向深部可分為透明軟骨層、鈣化軟骨層和軟骨下骨三層結(jié)構(gòu)。透明軟骨主要由軟骨細(xì)胞和Ⅱ型膠原蛋白與蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組成；鈣化軟骨層主要由少量肥大軟骨細(xì)胞和Ⅱ型膠原蛋白與羥基磷灰石等ECM組成；軟骨下骨主要由成骨細(xì)胞和Ⅰ型膠原蛋白與羥基磷灰石等ECM組成。關(guān)節(jié)骨軟骨的這種特殊結(jié)構(gòu)組成及其界面連接方式，不但有利于各層組織利用各自的生理微環(huán)境進(jìn)行新陳代謝，而且有利于其生物力學(xué)功能的發(fā)揮。ECM包括膠原和蛋白聚糖,其中軟骨細(xì)胞所特有分泌的膠原Ⅱ型膠原占膠原總量的九成, Ⅱ型膠原保障關(guān)節(jié)軟骨的抗張力強(qiáng)度,軟骨細(xì)胞活性降低導(dǎo)致Ⅱ型膠原分泌量下降，從而軟骨組織力學(xué)性能的減弱〔3〕。在對(duì)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)顯示動(dòng)態(tài)壓力(DC)刺激可維持Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成〔4〕。軟骨細(xì)胞在人體內(nèi)處于封閉力學(xué)環(huán)境中，根據(jù)模擬關(guān)節(jié)真實(shí)運(yùn)動(dòng)，軟骨細(xì)胞對(duì)壓應(yīng)力、張力、剪切力均敏感〔5，6〕。力學(xué)載荷促使軟骨細(xì)胞的正常功能和ECM正常表達(dá)的穩(wěn)定。

關(guān)節(jié)軟骨由軟骨基質(zhì)及軟骨細(xì)胞組成,軟骨細(xì)胞僅占軟骨體積的1%～5%,但合成ECM,并調(diào)節(jié)基質(zhì)的代謝，體外研究實(shí)驗(yàn)多采用的壓力方式有兩種：DC、靜態(tài)壓力(SC)。軟骨組織塊在SC下處于壓縮狀態(tài)，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞代謝能力的下降，細(xì)胞活性的衰落，抑制組織合成與代謝。目前國(guó)內(nèi)外研究軟骨體外保存培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中均靜態(tài)或SC，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中關(guān)節(jié)軟骨處在制動(dòng)狀態(tài)，缺乏應(yīng)力負(fù)荷刺激，使關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)蛋白聚糖含量下降，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)水和電解質(zhì)平衡紊亂細(xì)胞分解代謝加強(qiáng)，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)纖維化。在對(duì)大鼠模型膝關(guān)節(jié)屈曲固定制動(dòng)不同時(shí)間的研究證實(shí)了持續(xù)制動(dòng)會(huì)導(dǎo)致軟骨生物力學(xué)性能的下降，導(dǎo)致關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生〔7〕。根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)壓縮力可以刺激軟骨細(xì)胞的分化與代謝。而在對(duì)壓縮力性質(zhì)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)壓力刺激的效果更明顯〔8～10〕。關(guān)節(jié)軟骨日?；顒?dòng)時(shí)產(chǎn)生的即是動(dòng)態(tài)壓縮力，與關(guān)節(jié)日常功能一致，是軟骨在體內(nèi)受到的主要作用力〔11〕。DC的其他作用主要有以下幾個(gè)：①可維持細(xì)胞正常的滲透壓，減少細(xì)胞膜滲透性；②可在早期干預(yù)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展；③有助于軟骨細(xì)胞保持正常形態(tài)；④有利于超微結(jié)構(gòu)的恢復(fù)；同時(shí)在細(xì)胞新陳代謝中的作用無(wú)可比擬〔12〕。

膝關(guān)節(jié)在股骨遠(yuǎn)端與脛骨近端起到支撐、運(yùn)動(dòng)的作用,關(guān)節(jié)囊內(nèi)有滑液,起到營(yíng)養(yǎng)軟骨和潤(rùn)滑軟骨表面。股骨髁、半月板、脛骨平臺(tái)相互接觸,產(chǎn)生相對(duì)運(yùn)動(dòng),一種是滾動(dòng),另一種是滑動(dòng)〔13〕，一種可以想象成搟面杖壓面皮，一種為汽車車輪的滑動(dòng)，由此兩種合力產(chǎn)生的對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的表面剪切力。孫明林等〔14〕進(jìn)一步研究了在不同壓縮強(qiáng)度下獲得的組織工程軟骨性能，發(fā)現(xiàn)在0.4 Hz、20%壓縮強(qiáng)度、3 h滾壓時(shí)間的滾壓參數(shù)下，干細(xì)胞能更好地向軟骨細(xì)胞分化以及維持軟骨細(xì)胞表型。人正常行走膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)是由滾動(dòng)和滑動(dòng)共同構(gòu)成的,滾動(dòng)約占60%,滑動(dòng)約占40%;滾動(dòng)速度為0～15 cm/s,滑動(dòng)速度為0～35 cm/s〔15〕。

2 生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器的目的是為體外培養(yǎng)構(gòu)建提供合適的生物環(huán)境,通過(guò)組織工程培養(yǎng)獲得與人體組織相似的結(jié)構(gòu)與功能〔16〕，化學(xué)條件溫度以及CO2的控制可在細(xì)胞孵化箱內(nèi)調(diào)節(jié)，pH值的控制也可調(diào)節(jié)，對(duì)于物理因素的調(diào)節(jié)仍在探索中。用于軟骨培養(yǎng)的生物反應(yīng)器種類較多，由于目前沒(méi)有一個(gè)確定的結(jié)論，所以各反應(yīng)器施加的力不盡相同：流體剪應(yīng)力、液體壓力、拉伸、直接壓縮、變形剪應(yīng)力或其中力的組合〔17〕。目前仍沒(méi)有一種較為理想的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器及生物體外保存裝置的要求：裝置充分模擬人體生物環(huán)境，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物有效循環(huán)利用，使得裝置中的pH值、液體濃度、CO2含量等維持穩(wěn)定；能保證培養(yǎng)物內(nèi)部信號(hào)分子、營(yíng)養(yǎng)和廢物的有效運(yùn)輸，能施加有效力學(xué)刺激彌補(bǔ)體外培養(yǎng)的不足，但要保證施加力學(xué)刺激不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破壞及損傷，盡最大可能模仿體內(nèi)真實(shí)力學(xué)刺激環(huán)境。從功能上來(lái)看，組織工程反應(yīng)器與軟骨體外培養(yǎng)生物反應(yīng)器基本一致，都是提供與人體相似的生物環(huán)境與力學(xué)環(huán)境。軟骨保存反應(yīng)器的力學(xué)環(huán)境是為了抑制細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞生存率保持在一個(gè)較高水平。目前國(guó)內(nèi)外多為組織工程生物反應(yīng)器的研究探索，實(shí)驗(yàn)對(duì)象均為軟骨細(xì)胞或干細(xì)胞誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞，尚沒(méi)有完整的針對(duì)軟骨組織塊的生物反應(yīng)器。在對(duì)體外軟骨組織塊力學(xué)保存上沒(méi)有一個(gè)完善的標(biāo)準(zhǔn)，存在較多爭(zhēng)議，原因是多方面的：由于個(gè)體的差異及軟骨所處內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，難以有一個(gè)統(tǒng)一的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn);物理因素對(duì)體外培養(yǎng)產(chǎn)生的影響未引起足夠認(rèn)識(shí)，在生物反應(yīng)器中其生物和物理參數(shù)根據(jù)環(huán)境的不同而改變，隨著臨床需要的加大，組織工程研究的深入、機(jī)械控制技術(shù)以及生物材料應(yīng)用的提高，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物反應(yīng)器生物環(huán)境的精確控制，選擇最佳生物參數(shù)，建立體外培養(yǎng)即時(shí)控制反饋系統(tǒng)〔18〕。在保存液技術(shù)較為成熟的情況下，軟骨體外保存反應(yīng)器將成為軟骨體外保存的研究趨勢(shì)。

3 總結(jié)與展望

同種異體軟骨移植技術(shù)經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)及長(zhǎng)期跟蹤隨訪被證實(shí)為有效的治療關(guān)節(jié)損傷疾病的方法。隨著保存液技術(shù)的不斷發(fā)展，軟骨的保存時(shí)間得到有效延長(zhǎng)。從軟骨培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的發(fā)展看,軟骨細(xì)胞對(duì)很多物理因素都有響應(yīng),而力學(xué)因素的影響占重要位置。軟骨的體外培養(yǎng)中,若能施加力學(xué)刺激能提高軟骨細(xì)胞的成活率。要探索得到合適的力學(xué)條件,按照組織工程仿生的原理,還需研究關(guān)節(jié)的自然運(yùn)動(dòng)。

4 參考文獻(xiàn)

1衛(wèi)小春.關(guān)節(jié)軟骨〔M〕.北京:科學(xué)出版社,2007:1-83.

2Bae JY, Matsumura K, Wakitani S,etal.Beneficial storage effects of epigallocatechin-3-o-gallate on the articular cartilage of rabbit osteochondral allografts〔J〕.Cell Transplant,2009;18(5):505-12.

3Malinin T,Temple HT,Buck BE.Transplantation of osteochondral allografts after cold storage〔J〕.J Bone Joint Surg Am,2006;88(4):762-70.

4Wright MO,Nishida K, Bavington C,etal.Hyperpolarisation of cultured human Chondroeytes following cyclieal pressure-induced strain:evidence of a role for Alpha 5 beta 1 integrin as a chondrocyte mechanoreceptor〔J〕.Orthop Res,1997:15(5):742-7.

5顧 延,戴克戎,裘世靜,等.應(yīng)力降低導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變機(jī)理的形態(tài)學(xué)研究〔J〕.中華骨科雜志,1995;15(9):631-3.

6Shiu YT,Li S,Yuan S,etal.Shear stress-induced-fos activation is mediated By rho in a calcium-dependent manner〔J〕.Biochem Biophys Res Comm,2003;303(2):548-55.

7Hagiwara Y,Ando A,Chimoto E.Changes of articular cartilage after immobilization in a rat knee contracture model〔J〕.J Orthop Res，2009;27(2):236-42.

8Haugh MG, Meyer EG, Thorpe SD.Temporal and spatial changes in cartilage-matrix speciic gene expression in mesenchymal stem cells in response to dynamic compression〔J〕.Tissue Eng Part A,2011;17(23-24):3085-93.

9Sch?tti O,Grad S,Goldhahn J.A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells〔J〕.Eur Cell Mater,2011;22:214-25.

10沈士浩，李雪萍.應(yīng)力負(fù)荷與關(guān)節(jié)軟骨損傷〔J〕.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2013；28(5)：475-8.

11亓建洪,王 偉,吳雅迪,等.人異體骨軟骨移植物保存方法研究〔J〕.中國(guó)矯形外科雜志,2012;20(1):64-7.

12Jackson DW, Whelan J, Simon TM.Cell survival after transplantation of fresh meniscal allografts.DNA probe analysis in a goat model〔J〕.Am J Sports Med,1993;21 (4):540-50.

13陳啟明,梁國(guó)穗,秦 嶺,等.骨科基礎(chǔ)科學(xué)-骨關(guān)節(jié)肌肉系統(tǒng)生物學(xué)和生物力學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社,2003：420-80.

14孫明林,朱 雷,呂 丹,等.不同參數(shù)滾壓模式對(duì)兔BMSCs向軟骨細(xì)胞分化促進(jìn)作用的研究〔J〕.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志,2013;27(1):89-94.

15Guilak F,Butler DL, Goldstein SA,etal.Functional tissue engineering〔M〕.Berlin:Springer-Verlag,2004:332-400.

16樊瑜波，陶祖萊.組織工程生物反應(yīng)器的生物力學(xué) 〔J〕.醫(yī)用生物力學(xué),2005;20(4):203.

17張春秋，孫明林，李 江，等.節(jié)軟骨體外構(gòu)建力學(xué)環(huán)境的研究進(jìn)展 〔J〕.醫(yī)用生物力學(xué),2009;24(6)：462-7.

18王 華.剪切力對(duì)體外培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞代謝的影響〔D〕.武漢：武漢大學(xué),2011.