鄭 露，周 劍

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)所·重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121）

RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象，是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，通過一系列細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)引起細(xì)胞中mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。RNA干擾現(xiàn)象最早可追溯到20多年前。1990年為加深矮牽?；ǖ淖仙?，有人[1]導(dǎo)入了一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子控制的色素基因，可是結(jié)果與預(yù)期相反，許多花瓣顏色并未加深，反而呈雜色甚至白色。這是由于轉(zhuǎn)基因和同源的內(nèi)源基因的表達(dá)都被抑制了，Jorgensen把這個(gè)現(xiàn)象命名為共抑制（cosuppression）。這種基因抑制是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平的，因此又稱為轉(zhuǎn)錄后基 因沉默 （post－ transcriptional gene silencing，PTGS）。2001年，Elbashir等[2]在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用化學(xué)合成的21nt的雙鏈 RNA(double－stranded RNA，dsRNA)誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性 RNAi，RNAi技術(shù)迅速擴(kuò)展到哺乳動(dòng)物領(lǐng)域。1995年，Guo等[3]在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C.elegans）中的 par－1基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了正義與反義 RNA同樣能切斷 par－1基因的表達(dá)。1998年，F(xiàn)ire等[4]在利用反義RNA進(jìn)行線蟲基因阻斷時(shí)，發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA能夠引起的mRNA降解，于是將這一現(xiàn)象稱為RNAi。

1 原理

RNAi的作用機(jī)制被認(rèn)為包括起始階段、效應(yīng)階段、擴(kuò)增和擴(kuò)散階段[5]。

起始階段：較長(zhǎng)的dsRNA在ATP參與下被RNaseⅢ樣的特異核酸酶切割加工成21～23 nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA 的兩條單鏈末端為 5′磷酸和 3′羥基，且 3′端均有 2～3個(gè)突出的核苷酸。果蠅中的RNaseⅢ樣核酸酶稱為 Dicer。Dicer有解旋酶活性并含有 dsDNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)域。Dicer的類似物相繼在擬南芥、秀麗線蟲及哺乳動(dòng)物等機(jī)體中被發(fā)現(xiàn)。

效應(yīng)階段：siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA－induced silencing complex，RISC）?；罨?RISC在單鏈 siRNA引導(dǎo)下識(shí)別互補(bǔ)的信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)，并在 RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導(dǎo)鏈中心所對(duì)應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶進(jìn)一步降解，從而干擾基因表達(dá)。RNAi能高效特異地阻斷基因的表達(dá)，在線蟲，果蠅體內(nèi)，RNAi能達(dá)到基因敲除的效果。

擴(kuò)增和擴(kuò)散階段：siRNA不僅可引導(dǎo)RISC切割靶RNA，而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA。新合成的長(zhǎng)鏈dsRNA同樣可被RNaseⅢ樣核酸酶切割、降解而生成大量的次級(jí)siRNA。次級(jí)siRNA又可進(jìn)入合成、切割的循環(huán)過程，進(jìn)一步放大RNAi作用。這種合成、切割的循環(huán)過程稱為隨機(jī)降解性聚合酶鏈反應(yīng)（random degradative，PCR）。

2 應(yīng)用

2.1 抗病毒

病毒善于變異，適應(yīng)性強(qiáng)，且感染的場(chǎng)所是在細(xì)胞內(nèi)，故病毒感染性疾病較難治愈，一直以來是威脅人類健康的主要因素。RNAi為抗病毒研究提供了一個(gè)重要的策略。目前，人們用RNAi技術(shù)在人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等的多種抗病毒研究中取得了很多進(jìn)展。Randall等[6]證明了針對(duì)HCVRNA的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞4 d后可使細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的HCV－RNA降低80倍；Kapadia等[7]也證明了 siRNA特異抑制 HCV－RNA復(fù)制、阻止相關(guān)蛋白表達(dá)的作用。

2.2 腫瘤的基因治療

用RNAi特異性地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的過度表達(dá)，使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望用這種新的手段治療各種惡性腫瘤。目前，發(fā)現(xiàn)促癌基因的激活、雜合等位基因的喪失及與腫瘤生物學(xué)特性相關(guān)基因的表達(dá)異常等因素與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。這些異常表達(dá)基因的蛋白產(chǎn)物與正常組織細(xì)胞的同類蛋白并無差異，因此在蛋白水平抑制它們的表達(dá)，不能很好地區(qū)分正常細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞。但這些基因變異往往反應(yīng)在mRNA水平上，故siRNA很可能成為能夠特異作用于腫瘤的理想抗癌藥物。Calin GA等[8]首次證明了miRNA在某些類型的白血病和淋巴瘤患者體內(nèi)發(fā)生了功能障礙，其中2種 miRNA（miR215和miR216）起著關(guān)鍵作用。癌基因ras在大約20%的癌癥中因突變而發(fā)生了過表達(dá)或活化。Johnson等[9]發(fā)現(xiàn)ras受Let－7家族的調(diào)控，其中包括線蟲的 ras基因、人的 k－ras、h－ras和 n－ras基因。Takamizawa J等[10]首次發(fā)現(xiàn)了let－7 miRNA在肺癌中低表達(dá)。最近，Hayashita Y等[11]又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與肺癌相關(guān)的miRNA簇——miR－17－92，miR－17－92在多數(shù)肺癌細(xì)胞株中過量表達(dá)，而且導(dǎo)入外源miR－17－92可顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。He L等[12]證實(shí)，miR－17－92在B細(xì)胞淋巴瘤中也呈高表達(dá)狀態(tài)。由于RNAi具有高度的特異性并能高效調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，近年用RNAi技術(shù)在多種不同的腫瘤細(xì)胞中成功干擾了多種靶基因的表達(dá)，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，已成為目前腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。

2.3 心血管疾病治療中的應(yīng)用

有學(xué)者已將RNA干擾技術(shù)成功運(yùn)用于先天性心臟病、擴(kuò)展性心肌病、病毒性心肌炎、心力衰竭、心肌肥厚等，如成簇粘附激酶（focaladhesionkinase，F(xiàn)AK）信號(hào)通路在心肌肥大中起了重要作用。Clemente等[13]將針對(duì) FAK的siRNA通過頸靜脈注入小鼠體內(nèi)，從而減少心肌纖維化，阻止了心肌的肥厚。

2.4 其他疾病治療中的應(yīng)用

RNAi技術(shù)正越來越多被應(yīng)用于其他許多疾病的治療研究。如內(nèi)分泌系統(tǒng)中的糖尿病，血液系統(tǒng)中的鐮狀細(xì)胞性貧血，消化系統(tǒng)中的肝纖維化，呼吸系統(tǒng)中的急性肺損傷等。

2.5 藥物開發(fā)中的應(yīng)用

RNAi技術(shù)作為尋找新的藥物靶標(biāo)的工具，可以快速、大規(guī)模、高通量的對(duì)發(fā)現(xiàn)的藥物靶基因進(jìn)行功能分析。同時(shí)，基因藥物具有高度的序列特異性和非常小的藥物不良反應(yīng)，利用這個(gè)技術(shù)可以用于確定人類細(xì)胞中的疾病途徑，為小分子藥物篩選靶物質(zhì)以及建立新的生物制藥方法和診斷學(xué)方法。

3 面臨的問題

效率不高的載體系統(tǒng)?；虻陌邢蜣D(zhuǎn)運(yùn)未完全實(shí)現(xiàn)，成為RNAi技術(shù)能否進(jìn)入臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問題。近年來在新型載體的開發(fā)、應(yīng)用單鏈片段抗體技術(shù)選擇性導(dǎo)入siRNA及siRNA的化學(xué)修飾以提高生物穩(wěn)定性等方面研究取得了一定的進(jìn)展，有望加快突破這個(gè)障礙[14－15]。

RNAi的特異性是相對(duì)的。某些情況下siRNA能在翻譯水平抑制與之不完全相關(guān)的基因表達(dá)，即“脫靶”現(xiàn)象，須從siRNA的設(shè)計(jì)，siRNA的位置特異性修飾等方面研究解決的方法[16－17]。RNAi的具體分子機(jī)制研究。

RNAi機(jī)制本身受哪些因子調(diào)控，不同種生物是否沿用同一種RNAi機(jī)制，RNAi的生物功能研究等方面的認(rèn)識(shí)還不足。

其他問題包括對(duì)基因認(rèn)識(shí)的廣度和深度還難于滿足實(shí)際應(yīng)用的需要，未實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)準(zhǔn)確操控外源基因表達(dá)的時(shí)間性和空間性。

4 結(jié)語

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，后基因組時(shí)代已經(jīng)到來，基因功能的研究越來越重要。最近興起的RNA干擾技術(shù)，以其快速、簡(jiǎn)便、高效的抑制基因表達(dá)受到科學(xué)家們極大的關(guān)注，成為基因治療的極具潛力的工具。目前RNA干擾在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、制藥、醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，隨著技術(shù)的成熟，相信在不久的將來這一技術(shù)會(huì)在生命科學(xué)的領(lǐng)域中大有作為，成為遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究的有力工具。

[1]Wassenegger M.Gene silencing[J].Int Rev Cytol，2002，219：61.

[2]Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21 － nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mam.malian cells[J].Na-ture，2001，411（6 836）：494 － 498.

[3]Guo S，Kemphues KJ.Par－ 1，a gene required for establishing polarity in C.elegans embryos，encodes a putative Ser／Thr kinase that is asymmetrically distributed[J].Cell，1995，81(4)：611 － 620.

[4]Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double－stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391(6 669)：806 － 811.

[5]Bühler M，Moazed D.Transcrip tion and RNAi in heterochromaticgene silencing[J].Nat Struct Mol Biol，2007，14（11）：1 041 － 1 048.

[6]Randall G，Panis M，Cooper JD，et al.Cellular cofactors affecting hepatitis C virus infection and replication[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（31）：12 884 － 12 889.

[7]Kapadia SB，Chisari FV.Hepatitis C virus RNA replication is regulated by host geranylgeranylation and fatty acids[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（7）：2 561 － 2 566.

[8]Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al.Frequent deletions and down －regulation of microRNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(24)：15 524 －15 529.

[9]Johnson SM，Grosshans H，Shingara J，et al.RAS is regulated by the let－ 7 microRNA family[J].Cell，2005，120(5)：635 － 647.

[10]Takamizawa J，Konishi H，Yanagisawa K，et al.Reduced expression of the let－7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival[J].Cancer Res，2004，64(11)：3 753 － 3 756.

[11]Hayashita Y，Osada H，Tatematsu Y，et al.A polycistronic microRNA cluster，miR －17－92，is overexpressed in human lung cancers and enhances cell proliferation[J].Cancer Res，2005，65(21)：9 628 － 9 632.

[12]He L，Thomson JM，Hemanm MT，et al.A microRNA polycistron as a potential human oncogene[J].Nature，2005，435(7 043)：828 － 833.

[13]Clemente CF，Tornatore TF，Theizen TH，et al.Targeting focal adhesion kinase with small interfering RNA prevents and reverses load－induced cardiac hypertrophy in mice[J].Circulation Res，2007，101（12）：1 339－1 348.

[14]MingKai X，ChengGang Z.Gene expression and function study of fusion immunotoxin anti－Her－2－scFv－SEC2 in Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol，2006，70（1）：78 － 84.

[15]Chougn S，Kim YJ，Kim S，et al.Chemical modification of siRNAs to imp rove serum stability without loss of efficacy[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，342（3）：919 － 927.

[16]Shabalina SA，Spiridonov AN，Ogurtsov AY.Computational models with thermodynamic and composition features improve siRNA design[J].BMC Bioinformatics，2006，7：65.

[17]Puthenveetil S， Whitby L， Ren J， et al.Controlling activation of the RNA－dependent proteinkinase by siRNAs using site－specific chemical modification[J].Nucleic Acids Res，2006，34（17）：4 900 － 4 911.