余長風(fēng)，杜 瓊

(1.仁壽縣人民醫(yī)院，四川 仁壽620500；2.四川省人民醫(yī)院，四川 成都610072)

心肌梗死(acute myocardial infarction AMI)是常見的心血管疾病，嚴(yán)重的威脅人類的生命安全[1]。臨床發(fā)現(xiàn)以動(dòng)脈粥樣硬化為基礎(chǔ)的不穩(wěn)定斑塊破裂是導(dǎo)致AMI的主要原因，而高三酰甘油血癥又是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素[2]。研究發(fā)現(xiàn)高三酰甘油血癥和動(dòng)脈粥樣硬化與遺傳因素有關(guān)，其中DNA甲基化異常是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生重要的遺傳因素之一[3]。載脂蛋白A5(APOA5)是目前已知的基因過度表達(dá)可以降低三酰甘油水平的一種載脂蛋白，但是APOA5-DNA甲基化對(duì)其APOA5表達(dá)水平的影響比較鮮見。本課題觀察高三酰甘油血癥合并AMI患者APOA5-DNA甲基化對(duì)APOA5-mRNA和APOA5蛋白表達(dá)水平的影響，旨在為AMI的早期診斷和干預(yù)提供一定的幫助，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年3月-2013年5月在我院收治的高三酰甘油血癥合并急性心肌梗死男性患者20例作為觀察組，選取同期在我院體檢的高三酰甘油血癥合并頸動(dòng)脈粥樣硬化男性患者20例作為對(duì)照組。觀察組：年齡(46.63±4.38)歲，體質(zhì)指數(shù)(BMI)：(21.03±0.74)kg/m2。對(duì)照組：年齡(45.72±4.53)歲，體質(zhì)指數(shù)(BMI)：(21.45±0.81)kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡30-55歲；(2)高三酰甘油血癥診斷符合《診斷學(xué)》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)AMI診斷符合《內(nèi)科學(xué)》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(4)頸動(dòng)脈粥樣硬化診斷參照美國超聲放射學(xué)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(5)入選前2周內(nèi)未曾服用調(diào)脂藥物；(6)自愿加入本研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肥胖和其他代謝性疾病患者；(2)合并高血壓、腦卒中、糖尿病及肝腎功能不全者。兩組患者在年齡、BMI等基線特征方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入對(duì)象均簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集和處理 采集所有患者空腹靜脈血2 ml，抗凝，靜置1 h，高速離心取血漿200 μl，置于-80℃冰箱保存，用于檢測(cè)APOA5水平。剩余的血液用于DNA和RNA提取。

1.2.2 DNA和RNA提取 采用酚-氯仿抽提法提純血液標(biāo)本中的DNA；采用人外周血淋巴細(xì)胞分離液(北京博邁斯生物科技有限公司)分離淋巴細(xì)胞后再采用Trizol試劑(上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司)提純血液標(biāo)本中的RNA。采用Nanodrop-ND3300 核酸蛋白分析儀(上海智巖科學(xué)儀器公司)分別測(cè)定血液標(biāo)本中DNA和RNA的濃度。

1.2.3 DNA甲基化分析 選擇觀察組和對(duì)照組各5例患者，采用illumina人類全基因組DNA甲基化研究芯片Methylation-450K(北京怡美通德科技發(fā)展有限公司)分別檢測(cè)兩組標(biāo)本中DNA甲基化的差異；采用生物信息學(xué)方法分析并比較兩組患者APOA5-DNA甲基化的差異，記錄兩組DNA甲基化的差異值，以差異值>0代表高甲基化，以差異值<0代表低甲基化；差異值的絕對(duì)值越大代表差異越大。

1.2.4 APOA5-mRNA表達(dá)水平 采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)兩組患者全血RNA中mRNA。按試劑盒說明書操作。

1.2.5 APOA5蛋白表達(dá)水平 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血漿中APOA5蛋白表達(dá)水平。按照人APOA5檢測(cè)ELISA試劑盒(上海博湖生物科技有限公司)說明書檢測(cè)兩組患者血漿中APOA5蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS16.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料均采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，組件比較檢驗(yàn)分析采用t檢驗(yàn)；以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組APOA5-DNA甲基化差異

兩組差異甲基化位點(diǎn)共有6026個(gè)(分布于2721個(gè)基因中)，其中位于CpG島的位點(diǎn)有3173個(gè)，不位于CpG島的位點(diǎn)有2853個(gè)；與對(duì)照組比較，觀察組DNA高甲基化的位點(diǎn)總共有4410個(gè)，其中位于CpG島的位點(diǎn)有2398個(gè)，不位于CpG島的位點(diǎn)有2012個(gè)；與對(duì)照組相比，觀察組DNA低甲基化的位點(diǎn)共有1616個(gè)，其中位于CpG島的位點(diǎn)有748個(gè)，不位于CpG島的位點(diǎn)有868個(gè)。共涉及信號(hào)通路178個(gè)。其中APOA5-DNA表現(xiàn)為高甲基化狀態(tài)，差異值為52.0384。

2.2 兩組的APOA5-mRNA表達(dá)水平比較

RT-PCR結(jié)果顯示：觀察組和對(duì)照組的APOA5-mRNA表達(dá)水平分別為[(0.036±0.015)vs(1.002±0.089)],觀察組明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.303，P<0.05)。

2.3 兩組APOA5蛋白表達(dá)水平比較

ELISA結(jié)果顯示，觀察組和對(duì)照組的APOA5蛋白表達(dá)水平分別為[(153.52±17.39) μg/L vs (198.26±23.44) μg/L],觀察組明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.449，P<0.05)。

3 討論

高三酰甘油血癥是動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病重要的危險(xiǎn)因素之一[4]。有研究表明，TG水平超過2.26 mmol/L者發(fā)生急性心肌梗死(AMI)的風(fēng)險(xiǎn)要比TG水平小于2.26 mmol/L者高50%左右[5]。APOA5是載脂蛋白基因家族成員之一，已發(fā)現(xiàn)其在調(diào)節(jié)甘油三酯方面具有重要的作用[6]。APOA5由肝臟合成分泌，主要分布與高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜微粒中,為目前發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)能夠降低血漿甘油三酯水平的載脂蛋白[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，高三酰甘油血癥合并冠心病患者的血清APOA5水平與血清甘油三脂水平呈負(fù)相關(guān)，因此推斷血清APOA5水平可能是冠心病等心血管疾病的影響因素[8]。

表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是遺傳-環(huán)境-疾病的關(guān)系紐帶，是指不涉及DNA 序列改變的基因或者蛋白表達(dá)的變化，并可以在發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中穩(wěn)定傳遞的遺傳學(xué)分支學(xué)科，主要包括DNA甲基化，組蛋白共價(jià)修飾，染色質(zhì)重塑，基因沉默和RNA編輯等調(diào)控機(jī)制[9]。

DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)，導(dǎo)致DNA結(jié)合蛋白和DNA主螺旋溝之間的結(jié)合能力下降，導(dǎo)致遺傳信息沉默，最終會(huì)導(dǎo)致生物學(xué)功能改變[10]。

近年來，由美國Illumina公司研發(fā)的人類全基因組DNA甲基化研究芯片，成為DNA甲基化研究的廣泛選擇對(duì)象，其集全面、高通量和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)為一體，一次可以檢測(cè)450k個(gè)甲基化位點(diǎn)，能覆蓋大約96%的CpG島[11]。研究發(fā)現(xiàn)人類全基因組DNA甲基化研究芯片與傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法在DNA甲基化檢測(cè)方面具有較強(qiáng)的一致性，但亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法需要大量的克隆測(cè)序，程序繁瑣并且價(jià)格昂貴[12]。因此，本研究采用人類全基因組DNA甲基化研究芯片進(jìn)行DNA甲基化的檢測(cè)。

目前，關(guān)于高三酰甘油血癥合并AMI患者的APOA5表達(dá)與其DNA甲基化之間的關(guān)系的報(bào)道尚比較少見。本研究選擇30-55歲的男性高三酰甘油血癥合并AMI患者進(jìn)行研究，排除了性別和激素水平對(duì)DNA甲基化的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組中高三酰甘油血癥合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者相比，觀察組中高三酰甘油血癥合并AMI患者表現(xiàn)為APOA5-DNA高甲基化。同時(shí)，進(jìn)行了RT-PCR和ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，觀察組中高三酰甘油血癥合并AMI患者的APOA5-mRNA表達(dá)水平和APOA5蛋白表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組中高三酰甘油血癥合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者，表明APOA5-DNA高甲基化表現(xiàn)為APOA5-mRNA和APOA5蛋白水平的低表達(dá)。

綜上所述，高三酰甘油血癥合并AMI患者APOA5-mRNA和APOA5蛋白水平降低均與APOA5-DNA甲基化水平增高有關(guān)，APOA5-DNA甲基化異?？赡軈⑴c了高三酰甘油血癥患者動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。本研究納入樣本數(shù)量較小，為獲得更加真實(shí)可靠的數(shù)據(jù)，尚待擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)一步深入研究。

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