田秋紅 張濤 趙亮

鼻咽癌患者鼻咽分泌物EB病毒DNA的臨床應(yīng)用價值

田秋紅 張濤 趙亮

目的 評價鼻咽癌患者鼻咽分泌物 EB 病毒 DNA(EBV-DNA)的臨床應(yīng)用價值。方法 55例慢性鼻咽炎患者 (A 組 )及 55 例鼻咽癌患者 (B 組 )的鼻咽分泌物標本 , 應(yīng)用熒光定量 PCR 檢測標本中的 EBV-DNA, 并將兩組的檢測結(jié)果進行分析。兩組的檢測陽性率采用χ2檢驗 , EBV-DNA 拷貝數(shù)比較采用軼和檢驗。結(jié)果 A、B 兩組的鼻咽分泌物 EBV-DNA 的陽性例數(shù)為 5 例、38 例 , 陽性率分別為9.1%、69.1%。可見 , B 組的陽性率顯著高于 A 組 , 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。A、B 兩組的的平均濃度分別為 0 copies/ml、(2.98±0.25)×102copies/ml, 可見 , B 組的平均濃度顯著高于 A 組 , 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。結(jié)論 采用熒光定量 PCR 技術(shù)能對鼻咽分泌物中的 EBV-DNA 進行檢測 , 從而在鼻咽癌的早期診斷、臨床分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后評估中具有重要的臨床應(yīng)用價值。

熒光定量 PCR ；鼻咽癌 ；EB 病毒 DNA ；鼻咽分泌物

鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma, NPC)在耳鼻喉科惡性腫瘤中比較常見 , 且發(fā)病隱匿 , 部分患者確診后 , 已經(jīng)出現(xiàn)了頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。從而使最佳的治療時機延誤 , 治療效果及預(yù)后較差 , 大大影響了患者的生存質(zhì)量及 5 年生存率［1］。因此 , 對鼻咽癌患者早期進行確診及治療 , 能夠有效的提高治療效果及預(yù)后。EB 病毒屬于一種皰疹病毒 , 通常長期在口咽部上皮細胞及 B 淋巴細胞中潛伏 , 以游離環(huán)狀 DNA 的形式存在于胞漿中。有文獻報道顯示 , 鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展與 EB 病毒關(guān)系密切 , 且在研究中對很多鼻咽癌患者的血清進行檢測 , 從而發(fā)現(xiàn)存在 EB 病毒抗體 , 與正常人群差異顯著［2］。同時 , 近年來熒光定量 PCR 技術(shù)的廣泛應(yīng)用 , 從而能夠?qū)?EB 病毒 DNA(EBV-DNA)含量進行檢測 , 在鼻咽癌的早期診斷和療效評估中意義重大。本文中 , 本院采用熒光定量 PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction, FQPCR)技術(shù)檢測經(jīng)病理確診的 55 例鼻咽癌患者及 55 例慢性鼻咽炎患者的鼻咽分泌物中 EBV-DNA 含量 , 并將結(jié)果進行比較分析 , 現(xiàn)總結(jié)如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 收集本院 2007 年 6 月 ~2012 年 6 月在門診確診的 55 例慢性鼻咽癌患者 (A 組 )及經(jīng)病理確診的 55 例鼻咽癌患者 (B 組 ), 其中 A 組男 35 例 , 女 20 例 , 年齡 37~79歲 , 平均年齡為 (52.2±10.7)歲。B 組男 33 例 , 女 22 例 , 年齡 36~81 歲 , 平均年齡為 (54.1±12.6)歲。B 組患者全部為非角化上皮細胞癌 , 病理分期：Ⅰ期 4 例 , Ⅱ期 19 例 , Ⅲ期 23 例 ,Ⅳ期9例。慢性鼻咽炎及鼻咽癌患者均采取鼻咽纖維鏡附帶的吸引系統(tǒng)及自制的吸管遠端收集裝置對鼻咽分泌物進行采集 , 采集分泌物后立即送檢。

1. 2 試劑及方法 將鼻咽分泌物采用吸管進行反復(fù)輕微吹打 , 將其振蕩搖勻 , 吸取 1.5 ml液體至離心管中進行 5 min離心 操 作 , 轉(zhuǎn) 速 為 12000 r/min, 將沉淀 物 收 集 后 , 加 入 50 μl DNA 提取液 , 充分振蕩搖勻。置入 100℃恒溫下 10 min, 再進行 5 min 離心操作 , 轉(zhuǎn)速為 12000 r/min, 提取上清液 2 μl制作擴增模板。雙末端標記熒光探針序列為 5'- (FAM)CTGTC TGTAAAGTCCAGCCTCC- (TAMRA) 3'。引物序列為 5'-TCTCTGCC TCCAGGCAAG-3'和 5'-AGAGGGCCTCCACCGT-3', 將 DNA 模板提取液添加至 PCR 反應(yīng)管中 , 反應(yīng)液總?cè)萘繛?50 μl。建立陰性對照、陽性對照、陽性標準品及質(zhì)控品。在 93℃進行 2 min, 93 ℃ 進行 30 s 至 55℃進行 60 s, 重復(fù) 10 個循 環(huán) , 93℃進行 30 s 至 5℃進行 45 s 重復(fù) 30 個循環(huán) , 操作結(jié)束后 ,儀器將顯示結(jié)果。檢測標準［3］：以 5×102copies/ml為界限 ,超過或等于該數(shù)值的為陽性 , 低于該數(shù)值的為陰性 , 拷貝數(shù)以 0 計。本檢測方法的特異度為 92.2%, 靈敏度為 63.3%。熒光定量核酸擴增儀購于美國 ABI公司 , EB 病毒核酸擴增熒光檢測試劑盒購于上?？迫A生物工程股份有限公司。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析 , 計量資料采用均數(shù) ± 標準差 ( x-±s)表示 , 計數(shù)資料采用 χ2檢驗 , 單向有序計數(shù)資料比較采用軼和檢驗 , 以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 兩組患者鼻咽分泌物中 EBV-DNA 陽性情況 A 組患者鼻咽分泌物中 EBV-DNA 陽性為 5 例 , 陰性為 50 例 , 陽性率為 9.1%, 而對照組鼻咽分泌物中 EBV-DNA 陽性為 38 例 ,陰性為 17 例 , 陽性率為 69.1%, 可見 , B 組的陽性率顯著高于A 組 (χ2=41.58, P＜0.01), 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2. 2 兩組患者鼻咽分泌物中 EBV-DNA 濃度情況 A 組的平均濃度為 0 copies/ml, B 組的平均濃度為 (2.98±0.25)× 102copies/ml, 可見 , B 組的平均濃度顯著高于 A 組 , 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。

3 討論

EB 病毒在鼻咽癌的發(fā)生及發(fā)展過程中意義重大。EB病毒對人體進行感染 , 在裂解期病毒基因中表達完全 , 細胞主要合成早期細胞內(nèi)抗原及衣殼抗原［4］。因此 , 在鼻咽癌患者內(nèi)存在多種較高水平的抗 EB 病毒相關(guān)抗原的抗體 , 而這些抗體中 , VCA/IgA 和 EA/IgA 抗體的檢測最具有診斷價值。絕大多數(shù)鼻咽癌患者的血清 VCA/IgA 抗體陽性 , EA 在 EB 病毒開始復(fù)制時產(chǎn)生 , 而鼻咽癌患者中 EA/IgA 抗體特異性較高［5］。因此 , EB 病毒已作為一種鼻咽癌腫瘤標志在鼻咽癌的診斷及預(yù)后評估中得到廣泛的應(yīng)用。且EB病毒已被國際癌癥研究機構(gòu)列為Ⅰ類致癌物質(zhì)［5］。

同時隨著 PCR 技術(shù)的發(fā)展 , 出現(xiàn)了熒光定量 PCR 技術(shù)(FQ-PCR)。該技術(shù)在常規(guī) PCR 基礎(chǔ)上加入熒光標記探針 ,把核酸擴增、分子雜交及光譜技術(shù)相互結(jié)合 , 從容能夠監(jiān)測擴增前標本中核酸模板的數(shù)量 , 從而能夠?qū)?PCR 進行定量檢測［2］。FQ-PCR 在治療監(jiān)測腫瘤或病毒、調(diào)控機體基因表達、診斷疾病中作用重大。

通常對鼻咽癌患者檢測 EBV-DNA 的標本有轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)、腫瘤組織、外周血中的血漿及血清等。而取淋巴結(jié)或腫瘤組織標本時 , 操作過程復(fù)雜 , 對患者造成較大的創(chuàng)傷 , 而血漿或血清標本操作簡便 , 但敏感度較差［1］。因此 , 需要找尋一種更簡便及靈敏度更高的標本取材途徑。因此 , 鼻咽分泌物中的腫瘤標志的檢測開始受到學(xué)者的關(guān)注。本文研究中, A、B 兩組的鼻咽分泌物 EBV-DNA 的陽性率分別為 9.1%、69.1%。B 組的陽性率顯著高于 A 組 , 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)。A、B 兩組的的平均濃度分別為 0 copies/ml、(2.98±0.25)× 102copies/ml, B 組的平均濃度顯著高于 A 組 , 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。且本檢測方法的特異度為 92.2%, 說明鼻咽分泌物中 EBV-DNA 的檢測結(jié)果在診斷鼻咽癌的早期診斷中具有一定的臨床價值。

總之 , FQ-PCR 技術(shù)操作簡便 , 定量準確 , 能夠定量的檢測鼻咽分泌物 EBV-DNA 陽性率及濃度情況 , 在鼻咽癌患者早期診斷及預(yù)后評估中具有重要的臨床意義。

［1］羅碧強 , 張麗衛(wèi) , 竇曉青 , 等 .鼻咽癌患者唾液中 EB 病毒特異性抗體水平檢測的價值 .廣東醫(yī)學(xué) , 2012, 33(6):828-830.

［2］劉飛 .鼻咽癌患者外周血 EBV-DNA 水平與癌組織細胞凋亡的相關(guān)性 .山東醫(yī)藥 , 2011, 51(50):97-98.

［3］張速林 , 李薇 , 曾蘭蘭 , 等 .聯(lián)合檢測 EB 病毒相關(guān)抗體和抗原對診斷鼻咽癌的價值 .華南國防醫(yī)學(xué)雜志 , 2011, 25(3):262-263.

［4］陳瑜萍 , 阮輝 , 肖志勇 .鼻咽癌患者 EB 病毒檢測的臨床意義 .成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報 , 2012, 7(2):266-268.

［5］陳冬平 , 齊斌 , 余意 , 等 .鼻咽癌遠期生存率及預(yù)后因素分析 .實用醫(yī)學(xué)雜志 , 2012, 28(12):1999-2001.

2014-05-20］

475000 開封市中醫(yī)院檢驗科 (田秋紅 )；開封市兒童醫(yī)院急診科(張濤 趙亮)