鄭 旭，王瑋琳，丁 旭，喬 萍*，劉 陽*

(1.吉林大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理系,吉林 長春130021；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢驗(yàn)局，吉林 長春130062)

1 萊姆病螺旋體簡介

萊姆病(Lyme Disease，LD)最早發(fā)現(xiàn)于美國的Lyme鎮(zhèn)并由此得名，萊姆病是由蜱傳播的一種自然疫源性、人畜共患疾病，通過肩突硬蜱感染人體宿主，可引起多系統(tǒng)器官損害，游走性紅斑、神經(jīng)炎、關(guān)節(jié)炎、心肌炎等。1982年Burgdorfer W等人成功從肩突硬蜱(Ixodes ricinus)中分離出萊姆病病原體——螺旋體[1]，螺旋體感染通常是開始于肩突硬蜱幼蟲階段,主要以哺乳動物為宿主，積聚于宿主中腸。十九世紀(jì)末美國CDC已報(bào)道病例200 000多例，二十世紀(jì)初也有數(shù)萬件病例。萊姆病分布較廣泛，全球70多個(gè)國家都有該病發(fā)生，我國已有30多個(gè)省市發(fā)生該病。

1984年螺旋體被正式命名為伯氏疏螺旋體[2]，屬于原核生物界螺旋體目螺旋體科疏螺旋體屬的一種,是一種單細(xì)胞疏松盤繞的左旋螺旋體,菌體長20-30 μm，寬0.2-0.3 μm。蜱傳播的疏螺旋體屬包含約40個(gè)種屬，通過不同的宿主相互作用和攜帶病原體的載體特異性，將螺旋菌分2個(gè)主群：回歸熱(RF)螺旋體和復(fù)雜狹義伯氏疏螺旋體。RF螺旋體通過“軟蜱”傳染，復(fù)雜狹義伯氏疏螺旋體通過“硬蜱” 引起萊姆病。宿主和載體的特異性可以更容易的區(qū)分RF和伯氏疏螺旋體。

伯氏疏螺旋體在細(xì)菌中是最復(fù)雜的一個(gè)，基因組包含950 kb線性染色體、范圍在9-62 kb，由不同的線性質(zhì)粒和環(huán)形質(zhì)粒組成，線性擴(kuò)增子有共價(jià)閉合端粒，擴(kuò)增子需要端粒解離酶ResT，基因組有很低的G+C，含量大約在28%左右。大約5%的螺旋體染色體和15%質(zhì)粒基因編碼130多個(gè)脂質(zhì)蛋白。螺旋體的外膜蛋白(outer surface proteins,Osp)大多是脂質(zhì)蛋白，已被報(bào)道的OspA、OspB、OspC、OspD、OspE和 OspF等。其中具有抗原性的是OspA、OspC和 OspF。許多文獻(xiàn)都研究過外膜蛋白，針對這些蛋白的抗原性采用相

應(yīng)抗體進(jìn)行檢測，其中應(yīng)用多克隆抗體檢測結(jié)合蛋白質(zhì)印跡法(Western blot )，以區(qū)分不同的致病病原體抗原，但至今仍然沒有一個(gè)準(zhǔn)確的抗原Marker，確定抗原Marker可以更好更快的檢測。外膜蛋白可以在萊姆病不同的發(fā)病階段被檢測，但每個(gè)階段如何檢測沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。許多學(xué)者也一直致力于這方面的研究。

伯氏疏螺旋體有數(shù)十幾種基因型：B.buredorferi sensu stricto、B.garinii、B.afzelii、B.japanica、B.valaisiana、B.1usitaniae、B.andersonii、B.tanulkii、B.turdi、B.bissetii、.B.hermsii、B.sinica、B.bavariensis sp.nov、B.spielmanii、 B.valaisiana 、B.yangtze sp.nov.等。其中，B.burgdorferi ss、B.afzelii、 B.bissettii、B.garinii、B.lusitaniae和B.bavariensis sp.nov.主要流行于歐洲中部，在美國B.burgdorferi ss是主要的病原體，我國病原體則以B.garinii為主，其次為B.afzelii 和B.burgdorferi ss。其中有四種基因型有致病性即狹義伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi sensus stricto)、伽氏疏螺旋體(B．garinii)、阿氏疏螺旋體(B．Afzelii)、B.spielmanii，其余的潛在病原體仍然不是很清晰。然而，在臨床病人體中存在的B.bissettii、B.lusitaniae和B.valaisiana也有跡象可能引起萊姆病[3-4]。

為了滿足實(shí)驗(yàn)診斷，許多新的檢測方法被應(yīng)用，如應(yīng)用酶聯(lián)反應(yīng)檢測特異性抗體、重組抗原、表位抗原；應(yīng)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測，如PCR、熒光定量PCR及聯(lián)合應(yīng)用RFLP、LAMP等。本文對萊姆病螺旋體的檢測方法進(jìn)行綜述，以期能夠?yàn)閷淼难芯刻峁椭?/p>

2 直接檢測

最初實(shí)驗(yàn)室的診斷是分離菌體，螺旋體通過BSK完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在生長14天后可在暗視野相差顯微鏡下觀察其形態(tài)，雖然現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)試劑都已經(jīng)商品化，大大縮短了原有的培養(yǎng)基準(zhǔn)備和配置時(shí)間，但仍無法做到快速檢測，所以培養(yǎng)菌體不是我們進(jìn)行檢測的主要手段。

3 免疫學(xué)技術(shù)檢測

萊姆病常常在感染初期階段被診斷，而游走性紅斑(EM)常作為臨床的診斷標(biāo)準(zhǔn)。但EM只在一部分病例中出現(xiàn)，大約40%的游走性紅斑患者血清呈陰性，也有感染后持續(xù)很多年才在健康人群中發(fā)現(xiàn)血清呈陽性。因此，不能作為確診的唯一標(biāo)準(zhǔn)。有些病人可能有非典型皮損，或沒有皮膚癥狀，但實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果陽性時(shí)也可診斷為萊姆病螺旋體感染。這些檢測通常旨在檢測特異的IgM 或IgG 抗螺旋體抗體。

最早的檢測方法是應(yīng)用間接免疫熒光檢測IIFA。ELISA也廣泛應(yīng)用于輔助診斷，但不能準(zhǔn)確分辨萊姆病的致病基因型，同時(shí)也會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，其靈敏性低。按照歐洲標(biāo)準(zhǔn)，在兩個(gè)階段進(jìn)行血清學(xué)診斷，第一階段包括應(yīng)用ELISA方法，檢測IgM和IgG抗體水平。第二階段應(yīng)用免疫印跡法(IB)進(jìn)一步檢測不確定的結(jié)果。此后經(jīng)過不斷的對比和改良，將第一階段的ELISA換成 IIFA再聯(lián)合 IB，大大提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。但這種檢測也還存在一定的缺陷，選擇一個(gè)合適的抗原對于血清學(xué)的檢測是很重要的，如p30、p31、p39、p83、Osp17可作為重要的抗原，但抗原的檢測會產(chǎn)生一定的交叉反應(yīng)，使得檢測仍無法得到十分準(zhǔn)確的結(jié)果，感染早期OspC是最要的抗原之一，蜱在幼蟲時(shí)感染螺旋體就可表達(dá)，部分學(xué)者認(rèn)為OspC和VlsE抗原可以作為檢測抗原。針對這些抗原除傳統(tǒng)的一些方法，現(xiàn)在普遍應(yīng)用的蛋白質(zhì)印跡法(Western blot )結(jié)果通過特異條帶表示,可以很好的區(qū)分疫苗反應(yīng)產(chǎn)生的抗體和自然產(chǎn)生的抗體,所以WB的特異性較傳統(tǒng)方法好。但因?yàn)闂l帶局限于主觀視覺可導(dǎo)致假陽性，抗體反應(yīng)也各有不同，所以診斷標(biāo)準(zhǔn)尚不明確。

螺旋體特異性抗原即使感染了幾周也不易察覺，也沒有明顯的感染癥狀，直接培養(yǎng)和普通PCR的診斷方法敏感性過低，近年來為了能在早期就可以檢測到感染的活體病原，學(xué)者通過淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(lym-phocyte transformation test，LTT)應(yīng)用裂解液裂解抗原檢測健康個(gè)體陰性血清與陽性血清，在臨床上即使應(yīng)用抗生素治療LTT也可以達(dá)到很高的準(zhǔn)確性和特異性[5]。應(yīng)用(LC)-MS/MS(gel-based liquid chromatography)和(2D)-LC-MS/MS技術(shù)檢測不同蛋白，在所檢測的286種蛋白中，有97種在三個(gè)致病螺旋體中發(fā)現(xiàn)，可作為靶蛋白應(yīng)用于普及性的疫苗以阻止不同種螺旋體所引起的萊姆病[6]。

隨著LD血清學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用重組抗原大大提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性，除外膜蛋白A、B、C、E、F，還有FlaA,BBK32，P35，VlsE和DbpA。重組蛋白在感染的不同階段針對IgG和IgM，大大提高了檢測效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性，在血清學(xué)診斷中重組抗原單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用，與應(yīng)用單獨(dú)全蛋白相比減少了交叉反應(yīng)。另外，也可以聯(lián)合應(yīng)用不同的免疫學(xué)方法檢測重組抗原，如ELISA-IB可增加靈敏性。目前部分學(xué)者研究發(fā)明一種新方法免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Immuno-PCR，IPCR)以感染螺旋體產(chǎn)生的宿主免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)，應(yīng)用重組抗原在體內(nèi)表達(dá)促進(jìn)免疫應(yīng)答產(chǎn)生相應(yīng)抗體進(jìn)行檢測[7]。IPCR是一種液相蛋白檢測方法，結(jié)合了PCR的靈敏性以及免疫分析為基礎(chǔ)的特異性和多樣性,對于直接檢測血液中的病原體和多宿主免疫應(yīng)答抗體的檢測，IPCR有潛在的可應(yīng)用性[8-9]。

除上述針對IgG和IgM抗體的體外實(shí)驗(yàn)檢測,也可通過自身的細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行增殖分析，萊姆病螺旋體細(xì)胞免疫應(yīng)答已被應(yīng)用到外周血單核細(xì)胞或病人感染組織的細(xì)胞。螺旋體功能性抗體檢測：有研究認(rèn)為,萊姆病早期的血清陰性結(jié)果是形成了特異的抗原—抗體復(fù)合物,阻礙了對自由抗體的檢測。抑制螺旋體抗體實(shí)驗(yàn)是通過螺旋體、臨床病人的血清、外源性補(bǔ)體共同培養(yǎng),觀察螺旋體生長抑制進(jìn)行判斷。循環(huán)免疫復(fù)合物抗體的檢測,首先將免疫復(fù)合物從血清中沉淀,然后裂解復(fù)合物,釋放抗體,以便抗體能被ELISA或Western blot檢測，這種方法適用于早期萊姆病常規(guī)檢測血清呈陰性的病例，以及判定陽性血清是否假陽性。

4 分子生物技術(shù)檢測

對于萊姆病螺旋體的分子生物學(xué)檢測主要是PCR方法，在大多數(shù)的研究中針對不同的基因序列設(shè)計(jì)引物，如針對OspC、OspA、16SrRNA、5S-23SrRNA。在實(shí)驗(yàn)診斷中，PCR方法因?yàn)榭焖偌跋鄬啽愣鸬胶苤匾淖饔茫鞣NPCR方法包括傳統(tǒng)PCR，巢式PCR，實(shí)時(shí)定量PCR。1989年第一次應(yīng)用PCR檢測螺旋體,與免疫學(xué)方法相比PCR檢測可以省去培養(yǎng)、觀察及操作中的時(shí)間損耗，且更為靈敏，在不斷的發(fā)展中，各種不同的PCR也日益完善。

在不同的病原體細(xì)菌中,對于診斷、流行病調(diào)查和對病原體中主要基因的追蹤，分子生物學(xué)提供了強(qiáng)有力的方法。PCR特異性應(yīng)用于體內(nèi)培養(yǎng)困難的病原體檢測同時(shí)也適用于感染螺旋體的檢測,如rrs編碼16SrRNA,ospA編碼外膜蛋白A,flaB編碼鞭毛等,以DNA為基礎(chǔ)的多種標(biāo)記物能夠區(qū)分螺旋體種類。

應(yīng)用于螺旋體鑒定的大部分方法，如PCR,脈沖場凝膠電泳，隨機(jī)擴(kuò)增DNA等,花費(fèi)大量時(shí)間和經(jīng)費(fèi)而且人為的錯(cuò)誤和污染也不能避免。PCR基礎(chǔ)方法中，巢氏PCR被認(rèn)為是臨床檢測螺旋體菌屬最敏感的方法之一，以基因內(nèi)部片段：flaB，5S,23S，ospA等為靶基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，雖然引物設(shè)計(jì)更復(fù)雜，但避免了交叉反應(yīng)。同時(shí)也減少了單一PCR產(chǎn)物的錯(cuò)配、人為原因等誤差，可更好的增加準(zhǔn)確性、重復(fù)性、敏感性。

熒光定量PCR技術(shù),融匯了PCR高靈敏性、DNA 雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點(diǎn),通過直接探測PCR過程中熒光信號的變化,以獲得定量的結(jié)果，使得檢測更方便快捷，擴(kuò)增靶基因的同時(shí)也可通過一個(gè)PCR過程檢測靶基因產(chǎn)物，減少環(huán)境對目的基因產(chǎn)物的污染。很多文章報(bào)道了以熒光PCR方法檢測螺旋體種屬水平，螺旋體基因如hbb,p66,recA,ospA，glpQ，16S rRNA等，區(qū)分狹義螺旋體種類，擴(kuò)增DNA的擴(kuò)增子很容易確定解鏈溫度，不需要以往的PCR過程。熒光PCR可快速檢測臨床樣本、動物組織、及環(huán)境中存在的病原體。

PCR有不同的靈敏性，包含種屬特異性探針的PCR相對傳統(tǒng)PCR以及高靈敏和特異性的實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)更有優(yōu)勢，例如針對5S-23S,16S,ospA特異性序列，以TaqMan(MGB)為探針檢測蜱中螺旋體病原體比TaqMan減少更多的錯(cuò)配。

PCR也可結(jié)合不同的檢測手段進(jìn)行診斷，主要有限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP) 和反向線狀印跡(Reverse line blot,RLB),但是PCR結(jié)合RFLP、RLB在區(qū)分本病病原時(shí)需要復(fù)雜的系統(tǒng),及專業(yè)的技術(shù)人員，費(fèi)時(shí)費(fèi)力,對實(shí)驗(yàn)操作要求較高。PCR方法用于檢測伯氏疏螺旋體時(shí)，由于其基因的多態(tài)性無法有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)直接鑒別伯氏疏螺旋體，所以也會花費(fèi)大量的鑒定時(shí)間。另一種核酸擴(kuò)增方法——環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[10]用于實(shí)驗(yàn)檢測，具有更高的靈敏性和擴(kuò)增效率，LAMP可以控制酶反應(yīng)的最佳溫度，相比傳統(tǒng)PCR在最后階段很少發(fā)生擴(kuò)增的抑制反應(yīng) ，較之前的方法簡便，但溫度的控制卻很難把握。

綜上所述，萊姆病的檢測所應(yīng)用的方法只是輔助檢測手段，不能作為確診的標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)今，因地域不同，感染蜱傳疾病的情況有所差異。同時(shí)蜱傳疾病的菌種容易產(chǎn)生多種變異菌株，各種遺傳和變異特性很難確定，不利于對萊姆病的預(yù)防和治療的研究，目前蜱傳疾病已引起許多學(xué)者的廣泛關(guān)注，隨著對其致病機(jī)理研究的更加透徹，其檢測方法的研究也勢必飛速發(fā)展。

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