劉娜，袁寶珠

重組蛋白產(chǎn)品，即通過 DNA 重組技術(shù)使目的基因在相應(yīng)宿主細(xì)胞中表達(dá)所獲得的蛋白產(chǎn)品。其中，E.coli 源的占 42%，酵母源的占 21%，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster overy，CHO）細(xì)胞源的占 29%。而在與治療和預(yù)防相關(guān)的重組蛋白中，CHO 細(xì)胞源的已近 70%[1]。

CHO 細(xì)胞是在 1957年由美國(guó)科羅拉多大學(xué)Theodore T.Puck 從一成年雌性倉(cāng)鼠卵巢中分離獲得的，其增殖快，在體外傳代上百次后仍保持增殖能力[2]。該細(xì)胞染色體數(shù)為 22 條，性狀和帶型特征獨(dú)特，因此早期多被用于遺傳學(xué)研究。

在表達(dá)重組蛋白方面，與 E.coli、酵母菌相比，CHO 細(xì)胞具有相對(duì)完善的蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)。此外，由于生物技術(shù)發(fā)展和高產(chǎn)篩選方法的逐步優(yōu)化，CHO 細(xì)胞已成為目前表達(dá)重組蛋白最為理想的細(xì)胞基質(zhì)[3]。然而，現(xiàn)階段 CHO細(xì)胞的重組蛋白產(chǎn)品的產(chǎn)量及活性尚無法完全滿足市場(chǎng)需求，傳統(tǒng)的改良手段已很難再提高 CHO 表達(dá)重組蛋白的能力。而細(xì)胞工程技術(shù)，特別是基因沉默（RNAi）技術(shù)，具有提高重組蛋白產(chǎn)量和（或）活性的巨大潛力。然而，在我國(guó)尚未見到利用此策略改造 CHO 細(xì)胞的報(bào)道。本文就CHO 細(xì)胞改造，尤其是基于 RNAi 技術(shù)的改造作簡(jiǎn)要綜述，為我國(guó)建立自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。

1 CHO 細(xì)胞生物學(xué)特性

1.1 適于重組蛋白表達(dá)的生物特性

CHO 細(xì)胞很少分泌內(nèi)源性蛋白，但可高表達(dá)成熟的外源蛋白。綜合起來，CHO 細(xì)胞適于重組蛋白表達(dá)的主要生物學(xué)特征如下[4]：

⑴翻譯后修飾功能：該功能使蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物功能方面接近于天然蛋白。CHO 可確保所表達(dá)的外源蛋白正確折疊，并具有很高的生物學(xué)活性。如CHO 細(xì)胞表達(dá)的人 sApo2L-Fc 融合蛋白，生物活性可高達(dá) 105IU/mg[5]。

⑵適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的能力：CHO 細(xì)胞易于從貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∩L(zhǎng)狀態(tài)（馴化-adaptation）。經(jīng)懸浮培養(yǎng)后，每天的平均比生長(zhǎng)速率由最初的 0.27 提高到 0.48，而目的蛋白的活性則可提高 300% 以上[6]。

⑶外源重組基因高效擴(kuò)增和表達(dá)的能力：目前已有二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）基因缺失的 CHO 變異體[7]。這兩種變異體分別經(jīng)甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）或蛋氨酸亞氨基代砜（methionine sulfoximine，MSX）強(qiáng)化篩選后，可增加重組蛋白的基因拷貝數(shù)，從而提高表達(dá)水平[8]。例如，當(dāng) MTX 濃度為 1.0 μmol/L 時(shí)，重組 IgG-E3.3的表達(dá)量提高 1 倍，并且生物活性也隨之增強(qiáng)[9]。

⑷產(chǎn)物胞外分泌功能：如在 CHO 細(xì)胞中選擇合適的信號(hào)肽后，重組蛋白（以熒光素酶為例）的產(chǎn)量可提高1.5 倍[10]。該特性大大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝下游的蛋白分離和純化過程[1]。

1.2 CHO 細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品

1987年，血纖維蛋白溶酶原激活劑（activase，r-tPA）在 CHO 細(xì)胞中首次成功表達(dá)，并獲得美國(guó) FDA 批準(zhǔn)用于臨床，標(biāo)志著以 CHO 細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物制藥時(shí)代的到來[11]。

目前國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)上市的治療產(chǎn)品有重組人促紅細(xì)胞生成素（EPO）、重組人 II 型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白、重組人表皮生長(zhǎng)因子衍生物等產(chǎn)品。在預(yù)防類產(chǎn)品中，主要是重組乙型肝炎疫苗。而 EBV 疫苗、艾滋病疫苗等的研發(fā)，也都在 CHO 細(xì)胞中取得了一定的進(jìn)展。

2 CHO 細(xì)胞改造策略

為提高 CHO 細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白的產(chǎn)量和（或）活性，人們已對(duì) CHO 細(xì)胞培養(yǎng)條件、表達(dá)載體系統(tǒng)及對(duì) CHO細(xì)胞本身進(jìn)行了多方面、多水平的改造。主要的改造策略可以分為傳統(tǒng)改造策略和細(xì)胞工程改造策略。

2.1 傳統(tǒng)策略

傳統(tǒng)的策略主要包括：①改良培養(yǎng)基成分：如使用丁酸鈉，該方法可明顯提高 CHO 細(xì)胞合成重組蛋白的產(chǎn)量[12]，但丁酸鈉濃度高時(shí)卻可加速細(xì)胞的凋亡；②建立無血清培養(yǎng)（SFM）方法[13]：該策略雖降低產(chǎn)物純化成本和減少血制品帶來的潛在危害性，但 SFM 往往導(dǎo)致細(xì)胞活力差，貼壁性差，外源蛋白分泌能力差等缺點(diǎn)；③載體優(yōu)化：構(gòu)建含有強(qiáng)啟動(dòng)子的重組載體[14]，如在表達(dá)載體中加入泛染色體開放元件（universal chromatin opening elements，UCOE）序列[15]，或是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）序列[16]，以提高目的基因轉(zhuǎn)錄效率。但上述策略并非從改進(jìn)宿主細(xì)胞自身生物學(xué)特性著手，因此改良效率有限。

2.2 細(xì)胞工程策略

近年來，人們開始通過細(xì)胞工程技術(shù)對(duì) CHO 細(xì)胞進(jìn)行改造。細(xì)胞工程技術(shù)，主要指應(yīng)用不同的分子生物學(xué)手段，改變不同類型細(xì)胞生物學(xué)功能的基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平，特別是通過基因敲除、基因過表達(dá)或基因沉默等影響與特定生物學(xué)功能相關(guān)基因的表達(dá)水平的技術(shù)，以獲得特定生物學(xué)功能發(fā)生改變的細(xì)胞[17]。而在 CHO 細(xì)胞的應(yīng)用研究中，主要利用改變與重組蛋白表達(dá)量或活性相關(guān)生物學(xué)功能基因表達(dá)水平的策略，提高目的重組蛋白的產(chǎn)量或活性。

基因敲除，為經(jīng)同源重組或鋅指核酸酶等介導(dǎo)，從基因組中敲除特定基因序列的技術(shù)策略[18]。例如，通過構(gòu)造具有特異性的鋅指核酸酶，特定敲除谷氨酰胺合成酶基因，建立 GS 缺失細(xì)胞系[7]。由于該技術(shù)相對(duì)較為復(fù)雜，所以在CHO 細(xì)胞改造過程中，人們更多地選擇靈活性更強(qiáng)的基因過表達(dá)和基因沉默策略。

基因過表達(dá)技術(shù)，即是通過基因轉(zhuǎn)染結(jié)合強(qiáng)啟動(dòng)子的使用，使特定基因高水平持續(xù)表達(dá)以獲得相應(yīng)細(xì)胞生物學(xué)特性的技術(shù)。例如，可以通過基因轉(zhuǎn)染 CHO 細(xì)胞，提高 Hsp70、Hsp40 的表達(dá)，促進(jìn)重組蛋白抗體的折疊和分泌，實(shí)現(xiàn)重組蛋白生產(chǎn)的優(yōu)化[19]。另外，通過抗凋亡蛋白的過表達(dá)，提高細(xì)胞對(duì)凋亡的抗性而延長(zhǎng)生存時(shí)間，也可以實(shí)現(xiàn)重組蛋白產(chǎn)量的提高。如將外源 Bcl-2 抗凋亡基因轉(zhuǎn)入 CHO 細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)該蛋白過表達(dá)，提高抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的相對(duì)比值，可有效抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而提高目的重組蛋白（如hTPO）的產(chǎn)量[20-21]。

基因沉默，即通過降低基因轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性等方法，以關(guān)閉部分或全部基因的表達(dá)，從而獲得具有目的性狀的細(xì)胞。該策略一般經(jīng) RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。RNAi 技術(shù)作用機(jī)制類似于內(nèi)源途徑產(chǎn)生的 microRNA，可特異降解靶基因 mRNA。通過導(dǎo)入與靶基因 mRNA 特定區(qū)域互補(bǔ)的小分子 siRNA，經(jīng)互補(bǔ)配對(duì)可在細(xì)胞內(nèi)形成 RISC（RNA induced silencing complex），進(jìn)一步引起靶 mRNA 的降解或者阻止翻譯的進(jìn)行[8]。盡管CHO 細(xì)胞內(nèi)源 miRNA 表達(dá)譜日漸清晰[22]，但是內(nèi)源miRNA 并非按照人們意愿發(fā)揮作用，因此，利用 RNAi 技術(shù)靶向調(diào)節(jié)不同基因表達(dá)很有必要。目前，RNAi 可以簡(jiǎn)單地分為以下兩類：將外源合成的 siRNA 通過質(zhì)脂體等轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)干擾靶基因的表達(dá)（此方法多用于驗(yàn)證RNAi 策略的有效性）；或是經(jīng)載體（如質(zhì)粒 DNA 載體或病毒載體）攜帶表達(dá) siRNA 特定 DNA 片段（shRNA）轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生 siRNA，長(zhǎng)期穩(wěn)定地抑制靶基因的表達(dá)，此方法可用于建立新的穩(wěn)定細(xì)胞系[8]。

利用基因沉默從不同的細(xì)胞生物學(xué)角度改造 CHO 細(xì)胞的主要策略包括以下 5 種：①減弱或破壞細(xì)胞凋亡機(jī)制；②影響細(xì)胞糖基化修飾功能[23]；③降低二氫葉酸還原酶活性[7]；④干擾乳酸脫氫酶 A 亞基表達(dá)[24]；⑤穩(wěn)定細(xì)胞骨架蛋白[25]等。而此處詳細(xì)介紹減弱細(xì)胞凋亡機(jī)制的策略。

生產(chǎn)用細(xì)胞經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間大規(guī)模培養(yǎng)后，有害代謝物的累積以及必要營(yíng)養(yǎng)成分的降低都可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這也極可能是影響重組蛋白產(chǎn)量提高的瓶頸之一。細(xì)胞內(nèi)除凋亡酶（如啟動(dòng)凋亡酶 caspase-8、9、10，效應(yīng)凋亡酶 caspase-3、7）外，還存在多種促進(jìn)凋亡的蛋白分子，如 Bax、Bak、Bad、Bim 等凋亡蛋白。凋亡誘導(dǎo)信號(hào)，經(jīng)內(nèi)外源通路及級(jí)聯(lián)反應(yīng)（cascade）的方式逐級(jí)放大，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[26]。

利用 RNAi 技術(shù)抑制凋亡過程的發(fā)生，可選擇不同的凋亡酶作為靶分子。例如通過 RNAi 技術(shù)抑制 caspase-3、caspase-7 的表達(dá)，可以有效降低丁酸鈉對(duì) CHO 細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，更為重要的是當(dāng)兩種凋亡酶表達(dá)經(jīng)同時(shí)導(dǎo)入兩個(gè) RNAi 而發(fā)生同時(shí)降低時(shí)，目的蛋白 hTPO 的表達(dá)產(chǎn)量顯著提高（55%）[27]；但是當(dāng)單純抑制 caspase-3 的表達(dá)，目的蛋白的表達(dá)量只提高了 16%[28]。

除凋亡酶外，也可選擇其他促凋亡蛋白作為 RNAi 技術(shù)的候選靶分子。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，通過選擇 Bak和 Bax 作為RNAi 靶蛋白的策略來改造 CHO 細(xì)胞，Bak 和 Bax 的表達(dá)同時(shí)降低，細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗能力增強(qiáng) 1.6 倍，同時(shí)目的蛋白（IFN-γ）的產(chǎn)量提高了 35%[29]。另外的例子是通過RNAi 技術(shù)干擾 Agl-2、Requiem 這兩個(gè)凋亡早期基因，并配合其他抗凋亡蛋白的過表達(dá)，可使 CHO 細(xì)胞合成目的蛋白（IFN-γ）量提高 2.5 倍[30]。因此，由于細(xì)胞內(nèi)存在多個(gè)促進(jìn)凋亡的蛋白，所以可根據(jù)情況選擇不同的蛋白作為RNAi 的靶分子，增強(qiáng) CHO 細(xì)胞的抗凋亡能力，最終提高目的蛋白的產(chǎn)量。

除抑制凋亡機(jī)制外，其他通過 RNAi 技術(shù)提高重組蛋白表達(dá)量或活性的策略包括：①降低 α-1，6 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因（Fut8）的表達(dá)（改造后的細(xì)胞 Fut8 基因的表達(dá)水平只有原來的 20%），進(jìn)而降低目的重組抗體的巖藻糖糖基化程度，其結(jié)果為提高抗體 Fc 段與其受體的親和力，減少血漿成分中對(duì)目的重組抗體相關(guān) ADCC 活性的限制，最終可提高目的抗體 ADCC 的活性百倍以上[23]；②建立新的DHFR 低表達(dá)的細(xì)胞系：利用 RNAi 技術(shù)降低 DHFR 表達(dá)所建立的新 CHO 細(xì)胞系較傳統(tǒng)基因敲除方法效率更高，因此能建立新的更有效的 DHFR 缺陷的 CHO 細(xì)胞株[8]；③限制乳酸脫氫酶（LDH）A 亞基基因的表達(dá)，抑制糖酵解中丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化，提高 CHO 細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)過程中乳酸積累所致凋亡的抵抗性，進(jìn)而提高目的重組蛋白（如TPO）的產(chǎn)量[24]；④通過降低 Cofilin 的表達(dá)維持細(xì)胞骨架蛋白的穩(wěn)定性，可從多方面（如促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄、減少凋亡等）增加細(xì)胞活性，進(jìn)而改善細(xì)胞合成外源重組蛋白的功能（如堿性磷酸酶 SEAP 的表達(dá)量可提高 60% 以上[25]）。

3 小結(jié)

長(zhǎng)期以來，為提高目的重組蛋白的產(chǎn)量和活性，人們已經(jīng)對(duì) CHO 細(xì)胞進(jìn)行了多方面的改造。在多種改造策略中，以 RNAi 技術(shù)為基礎(chǔ)的基因沉默策略，由于其操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、靈活及效率高等優(yōu)點(diǎn)，較傳統(tǒng)改造策略更具有技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)，并能從細(xì)胞工程的角度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行改造，因此必將是目前及未來改造 CHO 細(xì)胞和不斷提升其重組蛋白生產(chǎn)能力的主要技術(shù)策略。

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