張許萌，王林林，任浩，何琪楊，陳汝賢，解云英

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以胰島新生相關(guān)蛋白啟動子為靶點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型的建立與初步應(yīng)用

張許萌，王林林，任浩，何琪楊，陳汝賢，解云英

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所微生物化學(xué)室

建立以胰島新生相關(guān)蛋白啟動子為靶點(diǎn)的高通量篩選模型，用于胰島新生相關(guān)蛋白基因表達(dá)上調(diào)劑的篩選。

以敘利亞金黃地鼠基因組 DNA 為模板擴(kuò)增胰島新生相關(guān)蛋白核心啟動子序列，克隆至pGL4.17 質(zhì)粒載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒 pRL-TK 共轉(zhuǎn)染金黃地鼠胰島 β 細(xì)胞 HIT-T15，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測熒光素酶的表達(dá)活性。對瞬時轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，以豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯作為陽性對照來評價模型的有效性，并利用該細(xì)胞模型對本研究所的化合物庫進(jìn)行篩選。

構(gòu)建了重組熒光素酶報告基因質(zhì)粒 pGL4.17-INGAP，并成功轉(zhuǎn)染 HIT-T15 細(xì)胞株。對模型進(jìn)行優(yōu)化后，應(yīng)用陽性對照對其進(jìn)行評價，Z' 因子為 0.57，適用于進(jìn)行高通量篩選。用該模型篩選了本所化合物庫，其中白藜蘆醇顯示出較好的上調(diào)作用，EC50為 1.6 μg/ml。

成功建立了以胰島新生相關(guān)蛋白啟動子為靶點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型。

轉(zhuǎn)錄啟動子； 藥物評價，臨床前； 胰島新生相關(guān)蛋白

糖尿病是以高血糖為主要特征的代謝性疾病，并伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥，降低了患者的生活質(zhì)量[1]，胰島 β 細(xì)胞過度凋亡、功能減退是糖尿病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺發(fā)生發(fā)育過程中，將健康胰腺部分切除或胰管結(jié)扎后，某些誘發(fā)因子能夠刺激胰腺導(dǎo)管前體細(xì)胞分化成胰島 β 細(xì)胞，胰島功能可以通過 β 細(xì)胞再生得以部分恢復(fù)，這一過程即胰島新生[3-4]。

基礎(chǔ)研究已發(fā)現(xiàn)了一些誘發(fā)胰島新生的先導(dǎo)物，其中胰島新生相關(guān)蛋白（islet neogenesis associated protein，INGAP）是在尋找具有胰島新生活性的內(nèi)源性分子過程中發(fā)現(xiàn)的第一個治療性候選物[5]，在胰島新生過程中發(fā)揮著重要作用。已有動物實(shí)驗(yàn)表明，INGAP 能夠促進(jìn) β 細(xì)胞的增殖，逆轉(zhuǎn)I型糖尿病大鼠的高血糖癥狀[5-6]；另外，相關(guān)II期臨床研究證明，INGAP 能夠促進(jìn)內(nèi)源性胰島素分泌，改善血糖控制[7]。因此，INGAP 是一個潛在的安全有效的糖尿病治療新靶點(diǎn)。

本研究以 INGAP 基因啟動子為靶點(diǎn)，建立以細(xì)胞為基礎(chǔ)的、能夠檢測其轉(zhuǎn)錄活性的篩選模型，以期發(fā)現(xiàn)能夠特異性上調(diào) INGAP 表達(dá)的活性化合物，為糖尿病的治療提供新的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒 金黃地鼠胰島 β 細(xì)胞株 HIT-T15（ATCC CRL-1777）購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程（大連）有限公司；pGM-T 購自天根生化科技（北京）有限公司；pGL4.17（luc2/Neo）和 pRL-TK 由本所生物工程室惠贈。

1.1.2 工具酶和主要試劑 Ex Taq 酶、T4 DNA連接酶等購自寶生物工程（大連）有限公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基為美國 Thermo 產(chǎn)品；胎牛血清為美國 Gibco 公司產(chǎn)品；血液/細(xì)胞/組織基因組 DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）、普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒等購自天根生化科技（北京）有限公司；Dual-Glo 雙熒光素酶檢測試劑盒（E2920）為美國 Promega 公司產(chǎn)品；豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯（PMA）購自美國 Sigma 公司。

1.1.3 儀器 TC-312 型基因擴(kuò)增儀購自英國 Techne 公司；ChemiImager5500 化學(xué)發(fā)光成像儀購自美國 Biorad 公司；Q5000 微量紫外分光光度計為美國 Quawell Technology Inc 公司產(chǎn)品；EnVision 多功能微孔板檢測儀為美國 Perkin Elmer 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA 目的片段的體外擴(kuò)增 從敘利亞金黃地鼠肝組織抽提基因組DNA，并以此為模板，根據(jù) GenBank 收錄的 INGAP 基因全序列（AY184211.1）和啟動子調(diào)控元件所在位置[8]設(shè)計引物，上游引物5'CTGTAACCAGATGA TACGATGC 3'（下劃線表示 XhoI酶切位點(diǎn)），下游引物5' AGTTTCAGAGTGCTGCCTTG 3'，擴(kuò)增位于 2177 ~ 3256 bp 區(qū)域的 INGAP 基因啟動子序列 1080 bp。PCR 體系反應(yīng)條件為 94 ℃變性4 min；94 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 70 s（30 個循環(huán)）；72 ℃延伸 10 min。

將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收，與 pGM-T 載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，藍(lán)白斑法挑選陽性轉(zhuǎn)化子。擴(kuò)增質(zhì)粒，提取并測序鑒定，選取與 GenBank AY184211.1 序列同源性 100% 的克隆，命名為 pGM-INGAP。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 限制性內(nèi)切酶I與II酶切pGM-INGAP 和 pGL4.17，將目的片段與線性 pGL4.17 連接，即把 INGAP 基因啟動子序列定向插入到 pGL4.17 載體的熒光素酶報告基因上游，命名為 pGL4.17-INGAP。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α 進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒并鑒定。

1.2.3 瞬時轉(zhuǎn)染條件的建立與優(yōu)化 HIT-T15 細(xì)胞在含 10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔 2 ~ 3 天用 0.25% 胰酶消化傳代。在96 孔板中接種細(xì)胞，隔天待細(xì)胞貼壁生長融合度達(dá)到 90% 時，按照 Lipofectamine 2000 說明書將 pGL4.17-INGAP 和內(nèi)參質(zhì)粒 pRL-TK 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h 后用全培養(yǎng)基換掉轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng) 12 ~ 48 h 檢測熒光素酶的表達(dá)活性，并對影響轉(zhuǎn)染效率的因素如質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 雙熒光素酶活性測定 采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，以組成性活性的pRL-TK 作為內(nèi)對照，使重組質(zhì)粒的測量結(jié)果正態(tài)化。具體方法是：將檢測試劑置于室溫平衡后，按照說明書混合配制，待測板中棄去上清，用 PBS 洗 3 次后每孔加20 μl 細(xì)胞裂解液（PLB）裂解細(xì)胞 20 min，加入螢火蟲熒光素酶 50 μl，通過 Envision 微孔板多功能檢測儀讀取熒光素酶活性數(shù)值。然后每孔加海腎熒光素酶混合液 50 μl，立即檢測，讀數(shù)。

1.2.5 陽性對照的建立、模型評價及藥物篩選 為評價所構(gòu)建模型的有效性，在轉(zhuǎn)染 6 h 后，將已知的陽性化合物 PMA 作用于細(xì)胞模型，12 ~ 48 h 后檢測熒光素酶的表達(dá)活性，以此來考察 PMA 在該模型上的作用。

采用 Z'因子法評價該模型對高通量篩選的可用性，根據(jù)公式Z' = 1 – 3（σc++ σc-）/（μc+– μc-）計算 Z'因子值，其中 μc-和 σc-分別為陰性對照的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，μc+和 σc+分別為陽性對照的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。Z' ≥ 0.5 認(rèn)為適用于高通量篩選。按照建立的方法對本實(shí)驗(yàn)室保存的 100 余個天然產(chǎn)物進(jìn)行初步篩選，篩選濃度為 10 μg/ml，并對陽性化合物進(jìn)行評價。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DNA 目的片段的體外擴(kuò)增

以敘利亞金黃地鼠基因組 DNA 為模板擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了預(yù)期大小的目的片段（圖 1A），將其克隆至 pGM-T 載體，擴(kuò)增并提取純化質(zhì)粒后測序，測序結(jié)果與 GenBank（AY184211.1）中收錄的序列有 100% 同源性。

2.2 pGL4.17-INGAP 報告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

對構(gòu)建的 pGL4.17-INGAP 進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果表明，INGAP 基因上游調(diào)控序列定向插入到 pGL4.17 載體的熒光素酶報告基因上游（圖1B），成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pGL4.17-INGAP。

2.3 瞬時轉(zhuǎn)染條件的建立與優(yōu)化

以轉(zhuǎn)染 pGL4.17-basic 質(zhì)粒的 HIT-T15 細(xì)胞作為陰性對照，檢測轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒 pGL4.17-INGAP 的細(xì)胞熒光素酶活性，結(jié)果表明，后者的熒光素酶表達(dá)活性明顯增高，說明該啟動子片段能夠促進(jìn)熒光素酶的表達(dá)。同時對質(zhì)粒濃度和重組質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒比例進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)DNA:Lipofectamine 2000 比例為 1:3（w:V）、pGL4.17-INGAP:pRL-TK 比例為 100:1 時，轉(zhuǎn)染效率最高（圖2，n = 3）。

A：M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：INGAP 啟動子序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 B：M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pGL4.17-INGAP 經(jīng)Xho I和Bgl II雙酶切電泳結(jié)果

Figure 1 PCR product of INGAP promoter (A) and restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid pGL4.17-INGAP (B)

2.4 陽性對照的建立及模型評價

2.4.1 溶劑對熒光素酶活性的影響 在化合物篩選過程中，樣品一般溶解在 DMSO 中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng) DMSO 濃度小于 0.1% 時，基本不會對本模型產(chǎn)生明顯影響（圖 3A），因此，DMSO 的終濃度不能高于0.1%。

2.4.2 陽性化合物濃度對熒光素酶活性的影響 由于目前沒有能夠特異上調(diào)INGAP 的陽性藥物的報道，根據(jù)文獻(xiàn)選擇化合物 PMA 作為陽性對照[8]，并對PMA 在該篩選模型上的最佳作用濃度進(jìn)行探索。結(jié)果表明，當(dāng) PMA 濃度小于100 ng/ml 時，相對熒光素酶活性值隨著 PMA 濃度的增加而升高，呈現(xiàn)濃度依賴性（圖 3B），與文獻(xiàn)[8]報道一致，說明 PMA 能有效作用于該模型，提示 PMA 對 INGAP 基因表達(dá)的上調(diào)作用可以通過熒光素酶的表達(dá)活性反映出來。

2.4.3 化合物作用時間對熒光素酶活性的影響 轉(zhuǎn)染后 6 h 加入 PMA，分別在加藥后 20、24、30、42、72 h 檢測熒光素酶的表達(dá)活性。結(jié)果顯示，加藥后 30 h，熒光素酶表達(dá)活性隨著時間延長而升高，超過 30 h 后隨著時間延長活性降低，因此選擇最佳作用時間為 30 h（圖 3C）。

2.4.4 模型評價 以 PMA 為陽性對照，以 Z'因子為指標(biāo)對模型進(jìn)行評價，結(jié)果表明，本研究建立的模型 Z'因子為 0.57，優(yōu)于進(jìn)行高通量篩選試驗(yàn)所要求的大于 0.5 的標(biāo)準(zhǔn)，說明本研究建立的以 INGAP 啟動子為靶點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型穩(wěn)定可靠，適用于進(jìn)行高通量篩選。

2.5 化合物初步篩選結(jié)果

應(yīng)用該模型對本實(shí)驗(yàn)室保存的天然產(chǎn)物進(jìn)行篩選，上調(diào)率 150% 視為陽性，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對 INGAP 啟動子上調(diào)作用明顯。用不同濃度的白藜蘆醇作用于 pGL4.17-INGAP-HIT 細(xì)胞，結(jié)果顯示，白藜蘆醇對啟動子的上調(diào)作用呈現(xiàn)濃度依賴性，半數(shù)有效濃度為 1.6 μg/ml（圖 4A）。MTT 比色法檢測白藜蘆醇對 HIT-T15 細(xì)胞增殖活力的影響，發(fā)現(xiàn)其對細(xì)胞毒性較小，IC50= 34.27 μg/ml（圖 4B）。

A：轉(zhuǎn)染試劑濃度對熒光素酶活性的影響（***P < 0.001 vs 對照組）；B：重組質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒比例對熒光素酶活性的影響（**P < 0.05 vs 對照組；***P < 0.001 vs 對照組）

Figure 2 Establishment and optimization of the transient transfection model

A：DMSO 濃度對熒光素酶活性的影響（***P < 0.001 vs 對照組）；B：PMA 濃度對熒光素酶活性的影響（***P < 0.001 vs 對照組）；C：化合物作用時間對熒光素酶活性的影響

Figure 3 The establishment and optimization of the positive control

A：白藜蘆醇對pGL4.17-INGAP-HIT 細(xì)胞熒光素酶活性的影響；B：白藜蘆醇的細(xì)胞毒性檢測

Figure 4 Related bioactive research of resveratrol

3 討論

INGAP 是一個由 175 個氨基酸組成的、分子量為 16.8 kD 的分泌蛋白，屬于C 型凝集素超家族中的 Reg-III家族，主要在胰腺和小腸表達(dá)，在肝臟中也有少量表達(dá)[6]。INGAP 啟動子序列長約3 kb，包括了 TATA-box、CAAT box、AP-1 等通用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，還包括胰腺特有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，這些轉(zhuǎn)錄因子包括 PDX-1、PAN-1、Isl-1、Ngn3、NeuroD 等，在胰腺細(xì)胞分化過程中起到重要的指向作用，直接影響 INGAP 啟動子的活性[8-9]。我們選擇 HIT-T15 細(xì)胞作為載體，該細(xì)胞雖然高度分化，但仍保留了正常胰島細(xì)胞的很多功能，能夠內(nèi)源性表達(dá) PDX-1、NeuroD 和 PAN-1等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子[10]，提供了比較真實(shí)的 INGAP 在胰腺中表達(dá)的天然環(huán)境。另外，本研究選取的 INGAP 基因啟動子序列，包括了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和若干重要的順式作用調(diào)控元件等核心啟動子區(qū)域，能夠較好地反映活性物質(zhì)在體內(nèi)的綜合作用效果。

構(gòu)建的模型采用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)作為檢測手段，以海腎熒光素酶質(zhì)粒作為內(nèi)參，通過內(nèi)參的校正能夠把影響細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染準(zhǔn)確性的內(nèi)在因素的變化降到最小，并且利用該模型進(jìn)行篩選時，只需關(guān)注相對熒光素酶活性的變化，方法簡便、快捷、準(zhǔn)確、靈敏性高[11]。

利用該研究建立的模型對本研究所化合物庫進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對INGAP 啟動子有明顯上調(diào)作用，EC50= 1.6 μg/ml，具有深入研究的價值。白藜蘆醇是天然的多酚類化合物，多存在于葡萄和紅酒中，具有抗氧化、抗炎、激活抗衰老酶 sirtuin 等多種藥理特性[12]。已有研究表明，白藜蘆醇能夠促進(jìn)葡萄糖攝取、提高肝糖耐受量和對胰島素的敏感性，可能的機(jī)制是白藜蘆醇激活 SIRT-1，通過影響機(jī)體代謝水平來發(fā)揮降血糖作用，也可能是通過抑制胰島 β 細(xì)胞 KATP通道或者激活 GLP-1 途徑以促進(jìn)胰島素分泌[12-15]，但其與 INGAP 的關(guān)系尚無報道，那么，白藜蘆醇的抗糖尿病作用是否與上調(diào) INGAP 有關(guān)，我們將繼續(xù)進(jìn)行深入的研究。

綜上所述，本研究構(gòu)建了以 INGAP 啟動子為靶點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型，并篩選到了一個具有明顯上調(diào)作用的化合物白藜蘆醇。此模型的建立對探討基于 INGAP 藥物的分子作用機(jī)制以及探索開發(fā)新型糖尿病治療藥物都具有重要的意義。

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Establishment and preliminary application of a screening model for identifying up-regulators of INGAP expression

ZHANG Xu-meng, WANG Lin-lin, REN Hao, HE Qi-yang, CHEN Ru-xian, XIE Yun-ying

To establish a screening model for identifying up-regulators of INGAP expression and screen active compounds.

Syrian golden hamster genome was used as template to amplify the core promoter sequence of INGAP. Then the obtained promoter fragment was cloned into pGL4.17 vector to construct the recombinant plasmid which subsequently was co-transfected into HIT-T15 cell line together with the internal reference plasmid pRL-TK using Lipofectamine 2000. The luciferase activity was detected using dual-luciferase reporter assay system in 96-well format. After optimizing the conditions of transient transfection, PMA was used as positive control to assess the validation of the model. The compounds in the library of our institute were then screened.

The recombinant plasmid named pGL4.17-INGAP was constructed and successfully transfected into HIT-T15 cell strain. The model was evaluated by positive control after optimization, and Z' factor is 0.57, showing that the model was able to use for screening up-regulators. Among the screened compounds, resveratrol showed up-regulated activity with EC50value of 1.6 μg/ml.

The cellular screening model for identifying up-regulators of INGAP expression was established.

Transcription initiation site; Drug evaluation, preclinical; Islet neogenesis associated protein

XIE Yun-ying, Email: xieyy@imb.pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.003

國家自然科學(xué)基金面上項目（81072556）；十二五“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX09301-002-001-018）

解云英，Email：xieyy@imb.pumc.edu.cn

2013-12-03

Author Affiliation: Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China