張群，龐國進(jìn)，劉天會，王萍，馬雪梅，尤紅，叢敏

mRNA 發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因表達(dá)抑制或沉默，引起相應(yīng)的功能表型缺失，屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默機(jī)制[1-2]，在各個領(lǐng)域的特定基因沉默研究中應(yīng)用廣泛[3]。雙鏈 RNA 即小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA），通過引入雙鏈 RNA 引發(fā)特定靶基因沉默，比基因敲除技術(shù)更方便、快捷地顯示出基因的功能，已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最熱門的研究課題之一[4-5]。

T 淋巴細(xì)胞是發(fā)揮機(jī)體免疫功能最重要的一大細(xì)胞群，具有促進(jìn)或者調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫及體液免疫的功能。通過 siRNA 的方法干擾人外周血原代 T 淋巴細(xì)胞特定基因的表達(dá)，從而抑制 T 淋巴細(xì)胞相應(yīng)的功能或表型，對于研究 T 淋巴細(xì)胞特定基因的功能以及對 T 淋巴細(xì)胞功能的臨床干預(yù)等具有重要意義。但是，人外周血 T 淋巴細(xì)胞屬于原代懸浮細(xì)胞，化學(xué)合成的 siRNA 轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較低[6]。已有研究報道可采用Lipofectamine 2000 和 Lipofectamine RNAiMAX將化學(xué)合成的 siRNA 轉(zhuǎn)染進(jìn)入原代細(xì)胞或懸浮細(xì)胞[7-9]。FuGENE6、Hiperfect 和 EntransterTM-R 依其試劑盒說明書也可進(jìn)行原代細(xì)胞 siRNA 的轉(zhuǎn)染。為探討不同轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率，我們采用上述 5 種轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)熒光標(biāo)記的對照 RNA 轉(zhuǎn)染人外周血 T 淋巴細(xì)胞，篩選出介導(dǎo) RNA 轉(zhuǎn)染人外周血 T 淋巴細(xì)胞效率較高的轉(zhuǎn)染試劑EntransterTM-R，證明其能夠有效介導(dǎo)人工合成RNA 轉(zhuǎn)染人外周血原代 T 淋巴細(xì)胞，可作為今后進(jìn)行特定基因的 siRNA 轉(zhuǎn)染原代 T 淋巴細(xì)胞的實驗依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象和材料

1.1.1 對象 本研究共采集 10 例健康志愿者，由同例志愿者的 T 淋巴細(xì)胞完成同組實驗，所有實驗均通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并取得獻(xiàn)血者的知情同意書。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國 Gibco 公司；淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll液）購自美國 GE Health 公司；人 T 細(xì)胞富集液購自美國 Stem Cell 公司；CD3 抗體購自美國BD 公司；熒光標(biāo)記的 siRNA BLOCK-iT? Alexa Fluor?Red Fluorescent Oligo（對照 RNA），轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000、RNAiMAX 均購自美國 Invitrogen 公司；轉(zhuǎn)染試劑 FuGENE6 購自美國Promega 公司；Hiperfect 購自德國 Qiagen 公司；轉(zhuǎn)染試劑 EntransterTM-R 購自英格恩生物公司。

1.2 方法

1.2.1 人外周血原代 T 淋巴細(xì)胞的分離 健康成年人外周血，肝素抗凝，加人 T 細(xì)胞富集液后用Ficoll 液分離獲得 T 淋巴細(xì)胞。取 1×106個細(xì)胞重懸于 100 μl PBS，加 CD3 抗體 5 μl，室溫孵育20 min，PBS 洗滌后采用流式細(xì)胞儀檢測 T 淋巴細(xì)胞純度。其余細(xì)胞重懸于 RPMI 1640 培養(yǎng)基[含10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清]中，以 2×105個/孔的濃度種于 24 孔板，于 37 ℃，5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后用 RNA 試劑轉(zhuǎn)染。

1.2.2 5種不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率評價 各個轉(zhuǎn)染試劑組分別設(shè)單加轉(zhuǎn)染試劑組（對照組）和加轉(zhuǎn)染試劑及熒光標(biāo)記 RNA 組（實驗組）。實驗組分別按照 Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX、FuGENE6、Hiperfect 以及 EntransterTM-R 轉(zhuǎn)染試劑盒操作指南進(jìn)行 T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染，對照 RNA濃度為 100 nmol/L，轉(zhuǎn)染試劑按照試劑盒操作指南推薦劑量進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染 6 h 后洗滌細(xì)胞并重懸于RPMI 1640 培養(yǎng)基（含 10% 胎牛血清），在 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后 24 h 在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況并收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，篩選出轉(zhuǎn)染效率較高的轉(zhuǎn)染試劑。

圖1 經(jīng)人 T 細(xì)胞富集液試劑盒分離的細(xì)胞中 CD3+T 細(xì)胞的純度（A：細(xì)胞經(jīng) PE-同型抗體標(biāo)記后流式檢測圖；B：細(xì)胞經(jīng) anti-CD3 Ab-PE 標(biāo)記后流式檢測圖）Figure1 The purity of CD3+T cells isolated by human T cell enrichment cocktail (A: PE-isotype labeled cells; B: Anti-CD3 antibody-PE labeled cells)

圖2 不同轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)熒光標(biāo)記 RNA 轉(zhuǎn)染 T 淋巴細(xì)胞的熒光顯微鏡圖（× 200）Figure2 T-lymphocytes tranfected by fluorescently labeled RNA using different transfection reagents (× 200)

采用 EntransterTM-R 介導(dǎo)對照 RNA 轉(zhuǎn)染人T 淋巴細(xì)胞，對照 RNA 濃度與 EntransterTM-R 的配比分別為 100 nmol/L、2 μl 和 50 nmol/L、1 μl。轉(zhuǎn)染 6 h 后洗滌細(xì)胞并重懸于 RPMI 1640 培養(yǎng)基（含 10% 胎牛血清），在 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后 24 h 在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況并收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，比較兩種轉(zhuǎn)染條件下細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率的差異。

采用 EntransterTM-R 介導(dǎo)對照 RNA 轉(zhuǎn)染人T 淋巴細(xì)胞，對照 RNA 濃度為 100 nmol/L，EntransterTM-R 2 μl。轉(zhuǎn)染 6 h 后洗滌細(xì)胞并重懸于RPMI 1640 培養(yǎng)基（含 10% 胎牛血清），在 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于轉(zhuǎn)染后 24、48、72 h 收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組間比較采用 One-Way ANOVA，多組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人外周血 T 淋巴細(xì)胞分離鑒定

采用人 T 細(xì)胞富集液分離人外周血 T 淋巴細(xì)胞，流式檢測 T 淋巴細(xì)胞純度較高，達(dá)到 87.4%（圖 1）。

圖3 不同轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)熒光標(biāo)記 RNA 轉(zhuǎn)染 T 淋巴細(xì)胞的流式檢測圖（A：T 細(xì)胞對照；B：Lipofectamine 2000 對照；C：Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染對照 RNA；D：Lipofectamine RNAiMAX 對照；E：Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染對照 RNA；F：FuGENE6 對照；G：FuGENE6 轉(zhuǎn)染對照 RNA；H：Hiperfect 對照；I：Hiperfect 轉(zhuǎn)染對照 RNA；J：EntransterTM-R 對照；K：EntransterTM-R 轉(zhuǎn)染對照 RNA）Figure3 The transfection efficiency of fluorescently labeled RNA in T-lymphocytes by different transfection reagents detected by flow cytometry (A: T cell control; B: Lipofectamine 2000 control; C: Control RNA transfected by Lipofectamine 2000; D:Lipofectamine RNAiMAX control; E: Control RNA transfected by Lipofectamine RNAiMAX; F: FuGENE6 control; G: Control RNA transfected by FuGENE6; H: Hiperfect control; I: Control RNA transfected by Hiperfect; J: EntransterTM-R control; K: Control RNA transfected by EntransterTM-R)

2.2 5 種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率

采用 5 種轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)對照 RNA（100 nmol/L）轉(zhuǎn)染人外周血原代 T 淋巴細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 24 h 在熒光顯微鏡下觀察，Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX、FuGENE6、Hiperfect 組帶有熒光標(biāo)記的細(xì)胞較少，收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，轉(zhuǎn)染效率分別為（14.81 ± 1.03）%、（14.33 ± 1.24）%、（2.10 ±0.16）%、（1.69 ± 0.08）%；EntransterTM-R 組帶有紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞較多，流式檢測轉(zhuǎn)染效率為（72.24 ± 1.26）%，分別與其他 4 種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行比較，P < 0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖 2～4）。

2.3 EntransterTM-R 轉(zhuǎn)染的最佳條件

圖4 不同轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)熒光標(biāo)記 RNA 轉(zhuǎn)染 T 淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率Figure4 The transfection efficiency of fluorescently labeled RNA in T-lymphocytes by different transfection reagents

圖5 EntransterTM-R 介導(dǎo)不同濃度熒光標(biāo)記 RNA 轉(zhuǎn)染的顯微鏡圖（× 200）和流式檢測圖Figure5 Microscopic appearance and transfection efficiency detected by flow cytometry of 50 and 100 nmol/L fluorescently labeled RNA in T-lymphocytes by EntransterTM-R (× 200)

分別采用對照 RNA 濃度與 EntransterTM-R的配比為 100 nmol/L、2 μl 和 50 nmol/L、1 μl轉(zhuǎn)染人外周血原代 T 淋巴細(xì)胞，24 h 后顯微鏡下觀察兩種轉(zhuǎn)染條件下的細(xì)胞狀態(tài)相差不大，均較為良好；流式檢測轉(zhuǎn)染效率分別為 73.7% 和56.0%（圖 5）。隨后，我們采用對照 RNA 濃度100 nmol/L、EntransterTM-R 2 μl 的條件轉(zhuǎn)染人外周血原代 T 淋巴細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后 24、48、72 h 收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，熒光標(biāo)記陽性細(xì)胞比例分別為 73.3%、62.0%、56.6%（圖 6）。說明EntransterTM-R 介導(dǎo)熒光標(biāo)記對照 RNA 轉(zhuǎn)染人外周血原代 T 淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，而且轉(zhuǎn)染后隨時間延長熒光標(biāo)記陽性細(xì)胞比例雖然有所下降，但是 72 h 后仍可以保持較高水平。

3 討論

RNAi 是生物進(jìn)化過程中一種廣泛存在而且保守的機(jī)制[10]。在植物、昆蟲、原生動物以及哺乳動物等幾乎所有的真核細(xì)胞中，都發(fā)現(xiàn)了自然存在的RNAi 現(xiàn)象。RNAi 能夠引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默，是機(jī)體的一種天然防御本能。采用 20 多個核苷酸組成的短的雙鏈 RNA（siRNA）代替?zhèn)鹘y(tǒng)反義核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默的 RNAi 技術(shù)已經(jīng)迅速而廣泛地應(yīng)用到基因功能、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究等熱門領(lǐng)域[11-15]。

siRNA 因其帶有較高的負(fù)電荷，不能自動跨過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用[16-17]。因此，有研究設(shè)計并合成了用于攜帶 siRNA 進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑，例如脂質(zhì)體、膽固醇和多肽類等[18]。然而，這些轉(zhuǎn)染試劑主要用于細(xì)胞系細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞尤其原代懸浮細(xì)胞的研究較少。而原代培養(yǎng)因其細(xì)胞離體時間短，生物學(xué)特性和遺傳學(xué)特性與體內(nèi)更為接近，更適合于細(xì)胞功能、致病機(jī)制及藥物治療等的實驗性研究。盡管轉(zhuǎn)染效率與轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞種類、生長狀態(tài)、轉(zhuǎn)染方法及 siRNA 濃度等條件密切相關(guān)[19]，但在其他條件一致的情況下，為確保轉(zhuǎn)染的高效性，需要選擇一種可靠的轉(zhuǎn)染試劑，使之對人外周血原代T 淋巴細(xì)胞能夠發(fā)揮最佳效果。因此選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)化學(xué)合成 RNA 進(jìn)入人外周血原代T 淋巴細(xì)胞是 RNA 干擾的關(guān)鍵步驟。

本實驗從人外周血中分離培養(yǎng)原代 T 淋巴細(xì)胞，以其作為實驗材料，通過觀察不同轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)的熒光標(biāo)記的長度為 21～23 個核苷酸的對照RNA 的轉(zhuǎn)染效率，篩選出可用于后續(xù)轉(zhuǎn)染 siRNA的最佳轉(zhuǎn)染試劑，將為 T 淋巴細(xì)胞特定基因功能的研究提供更加理想的輔助手段。

以往有關(guān)原代 T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染的相關(guān)研究較少，張恒輝等[7]將不同濃度的 siRNA 經(jīng) Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染人外周血新鮮分離的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在 20 nmol/L 濃度下 siRNA 轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到41.7%；孫磊等[8]對人外周血分離的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞擴(kuò)增、傳代、培養(yǎng) 2～3 周后的細(xì)胞經(jīng) Lipofectamine 2000 進(jìn)行 siRNA（150 nmol/L）轉(zhuǎn)染，F(xiàn)ACS 檢測最高可獲得 68.1% 的轉(zhuǎn)染效率。李興花等[9]將帶綠色熒光的 siRNA 經(jīng) Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染人外周血分選的 CD4+CD25-T 淋巴細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率最高為（50.8 ± 0.61）%；王玉潔等[20]研究表明Lipofectamine RNAiMAX 是最適合介導(dǎo)化學(xué)合成siRNA 轉(zhuǎn)染原代肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑。本實驗在其他條件穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，選擇已經(jīng)用于介導(dǎo) siRNA轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞的下列 5 種轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX、FuGENE6、Hiperfect 以及 EntransterTM-R，24 h 后在熒光顯微鏡下觀察帶有熒光標(biāo)記的細(xì)胞并通過流式細(xì)胞儀檢測熒光標(biāo)記細(xì)胞所占總細(xì)胞的比率，以評價 5 種試劑的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示 Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX、FuGENE6、Hiperfect 的轉(zhuǎn)染效率均較低，低于 20%，與以往文獻(xiàn)[7-9]報道結(jié)果不一致，考慮原因可能是研究細(xì)胞不完全相同，尤其是文獻(xiàn)[8]中的人外周血分離調(diào)節(jié)性 T 淋巴細(xì)胞為經(jīng)擴(kuò)增、傳代、培養(yǎng) 2～3 周后的細(xì)胞，細(xì)胞特性不同于本研究中的人原代 T 淋巴細(xì)胞。EntransterTM-R 是一種 siRNA 專用轉(zhuǎn)染試劑，由納米高分子聚合物組成，其分子內(nèi)含有許多氨基，在生理 pH 下會發(fā)生質(zhì)子化，這些質(zhì)子化的氨基可以中和 siRNA 表面的負(fù)電荷，可轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞等傳統(tǒng)難轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在本實驗中，EntransterTM-R 對新鮮分離的原代 T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，能夠達(dá)到 70% 以上。

圖6 EntransterTM-R 介導(dǎo)熒光標(biāo)記 RNA 轉(zhuǎn)染 T 淋巴細(xì)胞 24、48、72 h 后熒光陽性細(xì)胞率的變化（A：T 細(xì)胞對照；B：24 h；C：48 h；D：72 h）Figure6 Percentage of fluorescence positive cells after 24, 48, 72 h transfection by EntransterTM-R (A: T cell control; B: 24 h; C:48 h; D: 72 h)

本實驗發(fā)現(xiàn)在對照 RNA 濃度與 EntransterTM-R的配比為 100 nmol/L、2 μl 和 50 nmol/L、1 μl 兩種轉(zhuǎn)染條件下，T 淋巴細(xì)胞狀態(tài)均較為良好，而前者（73.7%）轉(zhuǎn)染效率顯著高于后者（56.0%），因此，確定采用化學(xué)合成的 RNA 濃度 100 nmol/L、EntransterTM-R 2 μl 的條件來介導(dǎo) T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染；不僅具有較高的轉(zhuǎn)染效率，同時并不具有更高的細(xì)胞毒性，而較低的細(xì)胞毒性對 RNAi 實驗尤其重要。此外，本實驗通過檢測 RNA 濃度 100 nmol/L、EntransterTM-R 2 μl 的條件轉(zhuǎn)染 T 淋巴細(xì)胞后24、48、72 h 的熒光標(biāo)記陽性細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后隨時間延長熒光標(biāo)記陽性細(xì)胞比例雖然有所下降，但是 72 h 后仍可以保持較高水平（56.6%）。

因此，EntransterTM-R 能夠有效介導(dǎo)人工合成RNA 轉(zhuǎn)染人外周血原代 T 淋巴細(xì)胞，可以作為后續(xù) siRNA 轉(zhuǎn)染原代 T 淋巴細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)染試劑。

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