韓芳，陸巧妮，徐力昆，竇媛媛，李玉環(huán)

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西多福韋對人宮頸癌細(xì)胞CaSki內(nèi)人乳頭瘤病毒16抑制作用研究

韓芳，陸巧妮，徐力昆，竇媛媛，李玉環(huán)

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所生化室（韓芳、陸巧妮、李玉環(huán)）；100071 北京，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所（徐力昆、竇媛媛）

從抗病毒角度探討西多福韋對宮頸癌細(xì)胞 CaSki 內(nèi)人乳頭瘤病毒 16（HPV16）的抑制作用及對細(xì)胞周期的影響。

用 MTT 法檢測西多福韋對細(xì)胞的毒性；用實(shí)時定量 PCR 法檢測其對病毒E6、E7 mRNA 水平的影響；用 Western blot 方法檢測其對病毒蛋白 E6、E7 和細(xì)胞抑癌蛋白 p53、pRb 表達(dá)水平的影響；用流式細(xì)胞法檢測其對宮頸癌細(xì)胞周期的影響。

西多福韋對宮頸癌細(xì)胞毒性較正常細(xì)胞大?？墒笻PV16 陽性宮頸癌細(xì)胞CaSki 內(nèi) E6、E7 mRNA 和蛋白水平降低，最大抑制率分別為（33.38±8.00）%、（28.32±2.73）% 和 98.92%、97.46%；可以使p53、pRb 蛋白水平升高，最大濃度時可以上調(diào) 12.06 和 3.53 倍；對 HPV16 陰性宮頸癌細(xì)胞 C-33A p53 蛋白表達(dá)無影響，但可提高 pRb 蛋白水平；可導(dǎo)致CaSki 和C-33A 細(xì)胞發(fā)生 S 期阻滯，最高濃度組細(xì)胞相對對照組 S 期分別增加22.83% 和 67.64%。

西多福韋可以在對細(xì)胞無毒的濃度下，抑制宮頸癌細(xì)胞內(nèi)的 HPV16，誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生 S 期阻滯。

抗病毒藥； 人乳頭瘤病毒 16； 宮頸腫瘤； 西多福韋

宮頸癌發(fā)病率在女性惡性腫瘤中排第二位，持續(xù)性感染高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV），尤其 HPV16 是主要原因[1]。目前主要依靠外科切除法治療 HPV 相關(guān)疾病[2]，但復(fù)發(fā)率高。臨床上可用藥物很少，且副作用大、療效差，并不推薦使用[3]。

西多福韋（cidofovir，CDV）是新型的胞嘧啶核苷膦?；酌蜒苌铮糜谥委煱滩』颊呔藜?xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎。后續(xù)發(fā)現(xiàn)其具有廣譜的抗 DNA 病毒作用，其中包括人乳頭瘤病毒[4-5]。

本研究主要從抗病毒角度探討西多福韋對宮頸癌細(xì)胞 CaSki 內(nèi) HPV16 的抑制作用，同時考察其對宮頸癌細(xì)胞周期的影響，評價其對 HPV 感染治療的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 宮頸癌細(xì)胞 CaSki（HPV16 陽性）和 C-33A（HPV 陰性）購自美國菌種保藏中心（ATCC），由本實(shí)驗(yàn)室自行傳代保存；人胚肺成纖維細(xì)胞 HEL，由本實(shí)驗(yàn)室自行傳代保存。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均在 12 ~ 20 代之間。

1.1.2 試劑 RPMI 1640、MEM 液體培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、DMSO 購自美國 Sigma-Aldrich 公司；細(xì)胞總蛋白提取試劑盒購自美國 Thermo Scientific 公司；mRNA 提取試劑盒購自德國 Qiagen 公司；實(shí)時熒光定量 PCR 試劑盒購自美國 Invitrogen 公司；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.3 抗體 羊抗 HPV16 E6、鼠抗 HPV16 E7 購自美國 Santa Cruz Technology 公司；鼠抗 p53、pRb 購自美國 BD Pharmingen 公司；鼠抗 β-actin、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG、HRP 標(biāo)記的兔抗山羊 IgG 二抗購自美國 Cell Signal Technology 公司。

1.1.4 儀器 二氧化碳孵箱購自美國 Thermo Scientific 公司；倒置顯微鏡購自日本 Olympus 公司；Bio-Rad 濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)購自美國 Bio-Rad 公司；ABI 7500 Fast 實(shí)時熒光定量 PCR 儀購自美國 ABI 公司；流式細(xì)胞儀購自美國 Coulter Corp 公司。

1.2 方法

1.2.1 CDV 對不同細(xì)胞毒性的測定 將 CDV 用各細(xì)胞系對應(yīng)的完全培養(yǎng)基溶解，起始濃度為1000 μg/ml，2 倍梯度稀釋，共 8 個濃度。以每孔100 μl 加入預(yù)先 24 h 鋪好 CaSki、C-33A 和 HEL 細(xì)胞（1.5 × 104個）的 96 孔板中，每孔 100 μl，每個濃度設(shè) 3 個重復(fù)孔。同時設(shè)正常細(xì)胞對照孔，重復(fù) 3 孔。48 h 后，每孔加入 20 μl MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入 150 μl DMSO，振蕩 10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀 490 nm 處測量各孔的吸光值度。細(xì)胞存活率 =（實(shí)驗(yàn)孔值/對照孔值）× 100%。細(xì)胞存活率≥ 90% 則認(rèn)為 CDV 對細(xì)胞無毒。

1.2.2 實(shí)時定量 PCR 檢測 CDV 對 CaSki 細(xì)胞中 HPV16 E6、E7 mRNA 表達(dá)的影響 用培養(yǎng)基將 CDV 稀釋成 130、65 和 32.5 μg/ml 3 個濃度，以每孔 2 ml 加入預(yù)先 24 h 鋪好 CaSki 細(xì)胞（4 × 105個）的 6 孔板中，同時設(shè)立細(xì)胞對照孔。48 h 后終止培養(yǎng)，提取細(xì)胞內(nèi)的總 RNA，以 E6、E7 為目的基因，β-actin 為內(nèi)參基因，通過實(shí)時定量 PCR 檢測CDV 作用于 CaSki 細(xì)胞后，HPV16 E6、E7 mRNA 水平上的變化。HPV16 E6 上游引物：5' CT GCAATGTTTCAGGACCCA 3'，下游引物：5' TCAT GTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT 3'；HPV16 E7 上游引物：5' GAGGAGGAGGATGAAATAGATGGT 3'，下游引物：5' CACTTGCAACAAAACGTTACAA TATTG 3'；β-actin 上游引物：5' CCAACCGCGAGA AGATGA 3'，下游引物：5' CCAGAGGCGTACAGG GATAG 3'。條件為：50 ℃2 min；95 ℃5 min；95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。CDV 處理細(xì)胞后，E6、E7 基因的表達(dá)水平相對于對照組的變化倍數(shù)為2-△△CT倍。

1.2.3 Western blot 檢測 CDV 對 HPV16 病毒蛋白及細(xì)胞蛋白的影響 用完全培養(yǎng)基將 CDV 配制成 130、65、32.5 和 16.25 μg/ml 的 4 個濃度，以每孔 2 ml 分別加入預(yù)先 24 h 鋪好 CaSki（4 × 105個）的 6 孔板中，同時設(shè)立細(xì)胞對照孔。用完全培養(yǎng)基將 CDV 配制成 65、32.5、16.25 和 8.125 μg/ml 4 個濃度，以每孔 2 ml 分別加入預(yù)先 24 h 鋪好 C-33A 細(xì)胞（6 × 105個）的 6 孔板中，同時設(shè)立細(xì)胞對照孔。48 h 后終止培養(yǎng)，提取細(xì)胞內(nèi)的總蛋白，并定量檢測。以 CaSki 內(nèi) E6、E7、p53、pRb和 C-33A 內(nèi) p53、pRb 為目的蛋白，β-actin 為內(nèi)參，通過 Western blot 檢測蛋白水平的變化。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測 CDV 對宮頸癌細(xì)胞CaSki、C-33A 細(xì)胞周期的影響 用培養(yǎng)基將 CDV 配制成 130、65 和 32.5 μg/ml 3 個濃度，以每孔2 ml 加入預(yù)先 24 h 鋪好 CaSki 細(xì)胞（2 × 105個）的 6 孔板中。另外用培養(yǎng)基將 CDV 配制成 65、32.5 和 16.25 μg/ml 3 個濃度，以每孔 2 ml 加入預(yù)先 24 h 鋪好 C-33A 細(xì)胞（4 × 105個）的 6 孔板中。兩組實(shí)驗(yàn)均設(shè)立細(xì)胞對照孔。48 h 后終止培養(yǎng)，胰酶消化，用 70% 的乙醇 4 ℃固定細(xì)胞 12 h，經(jīng) RNase 消化，PI 染色后流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MTT 法檢測 CDV 的細(xì)胞毒性

CDV 對宮頸癌細(xì)胞 CaSki、C-33A、人胚肺成纖維細(xì)胞 HEL 的毒性不同（圖 1），作用 48 h 后，最大無毒濃度 TC0分別是 125、62.5和 500 μg/ml。

圖 1 CDV 的細(xì)胞毒性

Figure 1 Toxicity of CDV on different cells lines

2.2 CDV 對 CaSki 細(xì)胞中 HPV16 E6、E7 mRNA 表達(dá)的影響

PCR 結(jié)果顯示，CDV 在濃度為 130、65 和 32.5 μg/ml 時，作用于 CaSki 細(xì)胞 48 h 后，對CaSki 細(xì)胞 HPV16 E6、E7 mRNA 表達(dá)均有抑制作用，分別下調(diào)（33.38±8.00）%、（28.31±3.28）%、（23.16±2.75）% 和（28.32±2.73）%、（24.46±7.87）%、（16.26±4.98）%（圖 2）。

mRNA 相對表達(dá)量Relative expression of mRNA1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 130 65 32.5 0 CDV 濃度（μg/ml）Concentration of CDV (μg/ml)

Figure 2 qRT-PCR analysis of down-regulation of E6 and E7 mRNA levels in CaSki cells upon CDV exposure (*< 0.05,#< 0.05)

2.3 CDV對HPV16病毒蛋白及細(xì)胞蛋白的影響

Western blot 結(jié)果顯示，CDV 在濃度為 130、65、32.5 和 16.25 μg/ml 時，作用于 CaSki 細(xì)胞48 h 后，可下調(diào) CaSki 細(xì)胞內(nèi) HPV16 E6、E7 蛋白的表達(dá)（圖 3），分別下調(diào) 98.92 %、94.97 %、67.91 %、44.39 % 和 97.46 %、53.87 %、21.87 %、3.08 %，同時可以上調(diào)抑癌蛋白 p53、pRb 的表達(dá)，分別上調(diào) 12.06、6.21、1.11、1.66 倍和 3.53、2.62、0.98、0.08 倍（圖 4）。CDV 在濃度為 65、32.5、16.25 和 8.125 μg/ml 時，作用于 C-33A 細(xì)胞 48 h 后，可上調(diào)抑癌蛋白 pRb 的表達(dá)，分別上調(diào) 3.03、4.05、4.03 和 3.38 倍，但對 p53 表達(dá)無影響（圖 5）。

CDV（μg/ml） 130 65 32.5 16.25 對照Control HPV16 E6 HPV16 E7 β-actin

Figure 3 Western blot analysis of down-regulation of E6 and E7 protein levels in CaSki cells upon CDV exposure

CDV（μg/ml） 130 65 32.5 16.25 對照Control HPV16 E6 HPV16 E7 β-actin

Figure 4 Western blot analysis for up-regulation of protein levels of p53 and pRb in CaSki cells upon CDV exposure

CDV（μg/ml） 130 65 32.5 16.25 對照Control HPV16 E6 HPV16 E7 β-actin

Figure 5 Western blot analysis for the effects of CDV on protein levels of p53 and pRb in C-33A cells

2.4 流式細(xì)胞法檢測 CDV 對宮頸癌細(xì)胞 CaSki、C-33A 細(xì)胞周期的影響

CDV 在濃度為 130、65 和 32.5 μg/ml 時，作用于 CaSki 細(xì)胞 48 h 后，可使 CaSki 細(xì)胞發(fā)生 S 期阻滯（圖 6），并具劑量-效應(yīng)關(guān)系。最高濃度組細(xì)胞相對對照組 S 期增加了 22.83% ；CDV在濃度為 65、32.5 和 16.25 μg/ml時，作用于C-33A 細(xì)胞 48 h 后，可使 C-33A 細(xì)胞發(fā)生 S 期阻滯（圖 7），并具劑量-效應(yīng)關(guān)系，最高濃度組細(xì)胞相對對照組 S 期增加了 67.64%。

Figure 6 Flow cytometry analysis of CDV-inducted of S phase cell cycle arrest in CaSki cells

Figure 7 Flow cytometry analysis of CDV-inducted of S phase cell cycle arrest in C-33A cells

3 討論

CDV 具有廣譜的抗 DNA 病毒作用，其機(jī)制是主要活性代謝產(chǎn)物 CDVpp競爭性抑制病毒的DNA 聚合酶，抑制病毒復(fù)制[5]。臨床數(shù)據(jù)顯示西多福韋凝膠也有比較好的抗 HPV 作用，目前西多福韋的適應(yīng)證外用藥呈增加的趨勢，國內(nèi)外均期望將西多福韋開發(fā)為抗 HPV 藥物[6-9]。HPV 病毒復(fù)制完全依賴宿主細(xì)胞 DNA 聚合酶，因此，CDV 必然可以通過其他機(jī)制發(fā)揮抗HPV作用。

我們首先研究了 CDV 對不同細(xì)胞的毒性影響，結(jié)果顯示 CDV 對細(xì)胞毒性具有一定選擇性，在濃度大于 125μg/ml 時，就對 HPV 陽性宮頸癌細(xì)胞 CaSki 產(chǎn)生毒性，而濃度大于 500 μg/ml時才會對正常細(xì)胞 HEL 產(chǎn)生毒性。這種細(xì)胞毒性差異或許可以解釋臨床上觀察到的 CDV 可以特異性地破壞 HPV 感染病變組織，而對正常組織基本沒影響的現(xiàn)象[8-9]。

高危型 HPV 誘導(dǎo)宮頸癌是一個多步驟的過程，E6 和 E7 在誘導(dǎo)過程中起關(guān)鍵作用，其主要通過泛素化降解細(xì)胞抑癌蛋白 p53 和 pRb，使細(xì)胞在發(fā)生基因突變或 DNA 損傷時無法進(jìn)行周期調(diào)控、DNA 修復(fù)或細(xì)胞凋亡，從而引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[10-11]。因此，抑制 E6、E7 表達(dá)，重建 p53、pRb 信號通路是治療 HPV 引發(fā)的癌癥的有效策略。本研究顯示，CDV 在對細(xì)胞無毒的濃度下可以降低 HPV16 陽性宮頸癌細(xì)胞 CaSki 內(nèi) E6、E7 mRNA 和蛋白水平，提高 p53 和 pRb 蛋白水平，說明 CDV 體外具有抑制 HPV16 的作用，該結(jié)果與文獻(xiàn)[12]報道相符。我們還檢測了 CDV 對 HPV 陰性宮頸癌細(xì)胞 C-33A內(nèi) p53 和 pRb 蛋白的影響，發(fā)現(xiàn) p53 蛋白水平基本不變，但可以明顯提升 pRb 水平。通過對比 CDV 對 HPV16 陽性和陰性宮頸癌細(xì)胞的影響，我們推測 CDV 可以通過抑制病毒間接提升細(xì)胞中 p53 水平，而對 pRb 水平的影響可以通過抑制病毒和直接激活 pRb 蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)。另外，我們檢測了 CDV 對 CaSki 和 C-33A 細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明，CDV 使這兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期均發(fā)生了 S 期阻滯，這也反過來印證了 CDV 有激活 p53、pRb 蛋白表達(dá)的功能。CDV 對 HPV 陽性宮頸癌細(xì)胞的抑制作用，除了實(shí)驗(yàn)中觀察到的抑制病毒癌基因表達(dá)、提高細(xì)胞抑癌蛋白水平、阻滯細(xì)胞周期外，促進(jìn)細(xì)胞凋亡也是重要原因[13-15]。

綜上，CDV 可以在無毒濃度下，抑制宮頸癌細(xì)胞 CaSki 內(nèi)的 HPV16 病毒蛋白 E6、E7 的表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞抑癌蛋白 p53、pRb 的表達(dá)，并且可使細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，從而抑制增殖。CDV 對 p53 的上調(diào)是通過解除 E6 對 p53 的降解實(shí)現(xiàn)的，而對 pRb 的上調(diào)既可以通過解除 E7 對 pRb 的降解又可以直接激活。本研究可以作為支持 CDV 局部用藥治療 HPV 感染相關(guān)疾病的分子理論基礎(chǔ)。

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Anti-HPV16 activity of cidofovir on cervical carcinoma cells (CaSki)

HAN Fang, LU Qiao-ni, XU Li-kun, DOU Yuan-yuan, LI Yu-huan

To investigate the antiviral activity of cidofovir (CDV) against HPV type 16 in the CaSki cervical cancer cell line and its effects on the cell cycle.

Cytotoxicities of CDV in CaSki, C-33A and HEL were assessed by MTT assay. The mRNA and protein levels of E6 and E7 oncogene were analyzed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and Western blot. p53 and pRb protein levels were also detected by Western blot. The effect of CDV on cell cycle was analyzed by flow cytometry.

MTT assay showed that cytotoxicity of CDV was much greater in cervical carcinoma cells than in normal cells. In HPV16-positive CaSki cervical carcinoma cell line, qRT-PCR results showed that E6 and E7 mRNA levels were decreased. Meanwhile, Western blot analysis revealed that E6 and E7 protein levels had the same trend with mRNA. However, p53 and pRb protein expressions were found to be increased simultaneously. Moreover, pRb protein expression was found to be increased in the HPV16-negative C-33A cervical carcinoma cell line, while the level of p53 protein didn’t change. In addition, flow cytometry assay showed CDV could induce S phase arrest in both cervical carcinoma cell lines.

This study showed that cidofovir has antiviral activity through suppressing E6 and E7 oncogene expressions and could induce S phase arrest at nontoxic concentration.

Antiviral agents; Human papillomavirus 16; Uterine cervical neoplasms; Cidofovir

LI Yu-huan, Email: yuhuanlibj@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.005

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2012ZX09301-002-001- 015）

李玉環(huán)，Email：yuhuanlibj@126.com

2013-12-04

Author Affiliations: Laboratory of Oncology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China(HAN Fang, LU Qiao-ni, LI Yu-huan); Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100050, China (XU Li-kun, DOU Yuan-yuan)