孫琴 王武慶

內(nèi)淋巴積水對(duì)豚鼠外周前庭頻率感受功能的損傷

孫琴 王武慶

目的探討內(nèi)淋巴積水對(duì)豚鼠外周前庭頻率感受功能的損傷。方法健康豚鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組、術(shù)后2周組（A組）、術(shù)后4周組（B組）、術(shù)后8周組（C組），每組10只。術(shù)后組均行右側(cè)內(nèi)淋巴囊阻塞以建立內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型。于相應(yīng)時(shí)間段用冰水試驗(yàn)和旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)誘發(fā)并記錄眼震電圖，然后處死相應(yīng)組別動(dòng)物，取右側(cè)聽泡進(jìn)行切片并染色。結(jié)果冰水試驗(yàn)時(shí)，A組有4只豚鼠（40%）引出眼震，但是眼震較微弱，持續(xù)時(shí)間較對(duì)照組短、眼震速度較慢。其余術(shù)后各組均未引出明顯眼震。旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)時(shí)，對(duì)照組、A組、B組、C組左、右眼震慢相斜率無明顯差異（P＞0.05）。染色結(jié)果顯示，對(duì)照組耳蝸無膜迷路積水表現(xiàn)，而術(shù)后各組均出現(xiàn)不同程度膜迷路積水，前庭膜向前庭階膨出。術(shù)后時(shí)間越長，積水程度越嚴(yán)重。結(jié)論內(nèi)淋巴囊阻塞可有效建立膜迷路積水的動(dòng)物模型。內(nèi)淋巴積水主要影響前庭器官的低頻旋轉(zhuǎn)感受功能。（中國眼耳鼻喉科雜志，2014，14：214-217）

內(nèi)淋巴積水； 前庭外周器官； 頻率； 眼震電圖； 豚鼠

隨著越來越多的前庭檢測手段應(yīng)用于臨床，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)不同頻率檢測手段的相符性并不高，同一疾病采用不同刺激頻率檢查前庭功能，結(jié)果并不一致。由此推測，前庭疾患對(duì)前庭功能的影響可能具有頻譜特征，即特定的疾病只影響某一頻段的感受功能。Carey等［1］報(bào)道了17例梅尼埃病患者，76%冷熱試驗(yàn)陽性，但是甩頭試驗(yàn)雙側(cè)不對(duì)稱者僅占11.8%。Park等［2］研究了38例單側(cè)梅尼埃病患者，冷熱試驗(yàn)的異常比甩頭試驗(yàn)的結(jié)果不對(duì)稱性更高。冷熱刺激相當(dāng)于極緩慢的旋轉(zhuǎn)刺激［3-4］，而甩頭試驗(yàn)屬于高速［200～400（°/s）］、高加速度［3 000～4 000（°/s2）］旋轉(zhuǎn)刺激［5］，因此推測梅尼埃病的損傷具有頻率選擇特性。自1938年Hallpike等［6］最早揭示梅尼埃病患者的顳骨解剖中存在內(nèi)淋巴積水后，內(nèi)淋巴積水被普遍認(rèn)為是梅尼埃病的組織病

理學(xué)基礎(chǔ)。本研究利用內(nèi)淋巴囊阻塞以建立內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型，對(duì)其進(jìn)行不同頻率的前庭功能檢測，探討內(nèi)淋巴積水對(duì)前庭水平半規(guī)管壺腹嵴毛細(xì)胞的損傷是否具有頻率選擇性，從而為前庭感受器頻率特性的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選用體質(zhì)量250～300 g，耳廓反射靈敏、鼓膜完整（電耳鏡觀察）的封閉群普通級(jí)白色紅目豚鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組、術(shù)后2周組（A組）、術(shù)后4周組（B組）、術(shù)后8周組（C組），每組10只。

1.2 方法 將術(shù)后各組豚鼠行枕后硬膜外進(jìn)路內(nèi)淋巴囊阻塞術(shù)。均為右耳手術(shù)；分別將對(duì)照組、A組、B組、C組豚鼠在規(guī)定的時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行冰水試驗(yàn)和旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，進(jìn)行眼震電圖的記錄。針形記錄電極置于豚鼠右眼內(nèi)、外眥部，針形參考電極置于顱頂，記錄眼震的持續(xù)時(shí)間和頻率。冰水試驗(yàn)：將豚鼠固定于8 cm× 8 cm×20 cm大小的長方體木盒內(nèi)，固定頭部，并稍立起與地面成42°，使水平半規(guī)管與地面垂直；用注射器將1 mL冰水注入右側(cè)外耳道，記錄誘發(fā)眼震。旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)：將豚鼠固定于木盒內(nèi)，頭向下，木盒與地面呈48°，使雙側(cè)外半規(guī)管與地面平行；電機(jī)轉(zhuǎn)速為720（°/s），角加速度為1 200（°/s2）進(jìn)行旋轉(zhuǎn)刺激（向左、向右），記錄右眼眼震變化。以上眼震、眼動(dòng)記錄均在暗室中進(jìn)行。眼震電圖記錄完畢后，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死各組豚鼠，取右側(cè)聽泡進(jìn)行切片及蘇木素-伊紅（HE）染色。

豚鼠眼震電圖是一組具有快慢相的鋸齒波，其眼震參數(shù)包括眼震頻率和持續(xù)時(shí)間。因豚鼠無法完成對(duì)焦矯正，眼震頻率無法得知，我們認(rèn)為在其他條件一致的情況下，眼震慢相斜率可以代替眼震頻率進(jìn)行比較，故采用眼震慢相斜率作為眼震參數(shù)之一。眼震慢相斜率在圖形上表示為鋸齒波中坡度較緩斜率較小的部分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Stata 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，4組資料數(shù)據(jù)均成正態(tài)分布，且方差齊性，進(jìn)行t檢驗(yàn)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冰水試驗(yàn) 對(duì)照組眼震明顯，眼震持續(xù)時(shí)間較長。A組有4只豚鼠（40%）引出眼震，但是眼震持續(xù)時(shí)間較對(duì)照組短、眼震斜率較小，A組和對(duì)照組的眼震持續(xù)時(shí)間和眼震斜率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。其余術(shù)后各組均未引出明顯眼震（表1）。冰水試驗(yàn)相當(dāng)于極低頻率的前庭刺激，極低頻率的刺激作用于內(nèi)淋巴積水豚鼠的前庭功能時(shí)，未誘發(fā)出正常眼震，說明內(nèi)淋巴積水豚鼠的低頻前庭功能受到影響。

2.2 旋轉(zhuǎn)試驗(yàn) 對(duì)照組、A組、B組、C組眼震慢相斜率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組豚鼠向左或向右眼震慢相斜率無明顯差異，

說明內(nèi)淋巴積水對(duì)豚鼠前庭的高速或高加速度感受功能影響不明顯。

2.3 染色 對(duì)照組右耳耳蝸無內(nèi)淋巴積水表現(xiàn)。A、 B、C各組豚鼠右耳耳蝸有不同程度的內(nèi)淋巴積水，前庭膜向前庭階膨隆。術(shù)后時(shí)間越長，積水程度越重（圖2）。

3 討論

1965年，Kimura等［7］首次通過阻塞內(nèi)淋巴囊成功建立實(shí)驗(yàn)性內(nèi)淋巴積水的動(dòng)物模型，阻塞內(nèi)淋巴囊可以阻斷內(nèi)淋巴從前庭暗細(xì)胞和血管紋的邊緣細(xì)胞縱向流入內(nèi)淋巴囊，造成膜迷路積水，且積水程度隨術(shù)后存活時(shí)間延長而加重，1周約58%，2～4周約78%，1～2個(gè)月可達(dá)100%，平均80.3%。病理改變以頂圈最嚴(yán)重［8］。Albers等［9-10］報(bào)道術(shù)后1個(gè)月，僅頂轉(zhuǎn)少量毛細(xì)胞缺損，并且多為第3排外毛細(xì)胞；術(shù)后2個(gè)月，外毛細(xì)胞缺損加重，并有向下擴(kuò)展趨勢，且內(nèi)毛細(xì)胞亦出現(xiàn)缺損。電鏡下血管紋邊緣細(xì)胞退行性改變、空泡化、萎縮，基底細(xì)胞間隙增大，前庭膜間皮細(xì)胞層間隙增大，蝸管內(nèi)毛細(xì)胞纖毛間的相互聯(lián)系消失。手術(shù)法積水成功率高，且可以排除藥物對(duì)動(dòng)物的不良反應(yīng)，故我們在動(dòng)物造模時(shí)選用阻塞內(nèi)淋巴囊手術(shù)法。

正常情況下，前庭膜與基底膜夾角大約呈30°，前庭膜將基底膜以上空間分為前庭階和蝸管2部分。蝸管橫截面積約為基底膜以上空間的1/3。膜迷路積水時(shí)，前庭膜向前庭階方向膨隆，蝸管的橫截面積增加。光學(xué)顯微鏡下，可將膜迷路積水程度粗略分為3度。輕度：蝸管面積約占前庭階、蝸管總面積的1/3～1/2；中度：蝸管面積約占前庭階、蝸管總面積的1/2～2/3；重度：蝸管面積約占前庭階、蝸管總面積2/3以上［11］。Sperling等［12］采用前庭膜與骨螺旋板的角度來評(píng)價(jià)積水程度。正常：前庭膜不膨出；輕度：前庭膜膨出，但未抵達(dá)前庭階的骨壁；中度：前庭膜移位抵達(dá)前庭階骨壁，但與骨螺旋板夾角＜90°；重度：前庭膜移位抵達(dá)前庭階骨壁，與骨螺旋板夾角＞90°。在我們的實(shí)驗(yàn)中，也采用這種較為簡單、直觀的方法。

刺激外周前庭器官可通過前庭眼束引起眼球運(yùn)動(dòng)，即前庭眼反射。前庭眼反射現(xiàn)象已被應(yīng)用于臨床檢查前庭功能，如旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)、冷熱試驗(yàn)等，通過誘發(fā)性眼震電圖檢查前庭功能狀態(tài)。冷熱試驗(yàn)一直被認(rèn)為是前庭功能檢查的“金標(biāo)準(zhǔn)”，用于檢測水平半規(guī)管功能。但其所誘發(fā)的刺激頻率極低，約為0.025 Hz［3，13］。豚鼠對(duì)冰水反應(yīng)更強(qiáng)烈，故本實(shí)驗(yàn)中用冰水試驗(yàn)。動(dòng)物眼震記錄必須在清醒狀態(tài)下，以免麻醉后動(dòng)物眼球固定出現(xiàn)眼震記錄假陰性結(jié)果。眼震記錄需在暗室中進(jìn)行，排除燈光對(duì)動(dòng)物固視抑制的影響。動(dòng)物體位的固定與安放是誘發(fā)豚鼠眼震的技術(shù)關(guān)鍵。

動(dòng)物眼震記錄常用眼震電圖和鞏膜接觸式磁性線圈。有學(xué)者［4，14］用盤狀電極記錄眼震電圖。將豚鼠兩眼外眥部和頭頂部充分脫毛、脫脂后，將導(dǎo)電膏置于直徑10 mmAg-Agcl盤狀電極中，記錄電極貼于兩眼外眥部，參考電極置于頭頂部。但我們在實(shí)踐此法時(shí)有易受電磁干擾、皮膚電阻太大、導(dǎo)電性不強(qiáng)、靈敏度不高、電極不易固定等缺點(diǎn)，且此法對(duì)豚鼠進(jìn)行溫度試驗(yàn)是比較理想的，但對(duì)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)效果不理想；鞏膜接觸式磁性線圈記錄信號(hào)靈敏，能夠精確記錄眼動(dòng)，但是此設(shè)備價(jià)格昂貴［15］。有學(xué)者［16］用視頻記錄系統(tǒng)來記錄豚鼠誘發(fā)眼震，此法穩(wěn)定性好、靈敏度高、操作簡單。本實(shí)驗(yàn)采用針形記錄電極置于豚鼠右眼內(nèi)、外眥部，針形參考電極置于顱頂記錄眼震的持續(xù)時(shí)間和頻率。此法操作直觀、簡單，適用于冰水試驗(yàn)及旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)。豚鼠眼震電圖是一組具有快慢相的鋸齒波，動(dòng)物頭動(dòng)對(duì)記錄結(jié)果有干擾，試驗(yàn)中應(yīng)固定豚鼠頭部，減少干擾。

在本研究中，內(nèi)淋巴積水模型對(duì)冰水試驗(yàn)相當(dāng)敏感。術(shù)后2周時(shí)，切片顯示內(nèi)淋巴輕度積水，前庭功能測試顯示豚鼠眼震持續(xù)時(shí)間明顯變短，且眼震斜率降低。術(shù)后4周、8周時(shí)，內(nèi)淋巴積水逐漸明顯，前庭功能測試顯示冰水刺激時(shí)已無明顯眼震。冰水試驗(yàn)僅相當(dāng)于0.025 Hz極低頻率的前庭刺激，故我們認(rèn)為內(nèi)淋巴積水對(duì)前庭的低頻影響較大。在高速旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)中，

電機(jī)轉(zhuǎn)速為720（°/s），角加速度為1 200（°/s2），對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組豚鼠向左或向右眼震慢相斜率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中，豚鼠向左或者向右眼震斜率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮內(nèi)淋巴積水對(duì)豚鼠前庭的高頻高速感受功能影響有限。

梅尼埃病患者冷熱試驗(yàn)的異常比例比甩頭試驗(yàn)高［1-2］，而且甩頭試驗(yàn)的不對(duì)稱性比前庭神經(jīng)炎患者少見且數(shù)值更小［2］，推測梅尼埃病主要影響半規(guī)管的低頻功能。即使梅尼埃病患者進(jìn)行冷熱試驗(yàn)顯示100%單側(cè)前庭功能減弱，但半規(guī)管仍保留對(duì)高頻刺激的感受功能。梅尼埃病患者高頻功能完好是眩暈反復(fù)發(fā)作的原因，用慶大霉素破壞殘余的高頻功能是控制眩暈的生理基礎(chǔ)［1-2］。梅尼埃病患者死后的顳骨切片發(fā)現(xiàn)Ⅱ型毛細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而I型毛細(xì)胞數(shù)量無明顯變化［17-18］，因?yàn)棰蛐兔?xì)胞和規(guī)則傳入神經(jīng)相連接，后者主要傳導(dǎo)低頻感受功能［17］，這可能是梅尼埃病患者低頻功能受損的基礎(chǔ)?？梢姡瑑?nèi)淋巴積水主要影響前庭器官的低頻旋轉(zhuǎn)感受功能。此研究提出內(nèi)淋巴積水導(dǎo)致前庭功能低頻區(qū)功能受損，其低頻受損的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)有待于進(jìn)一步的研究。

［1］Carey JP，M inor LB，Peng GC，et al.Changes in the threedimensional angular vestibulo-ocular reflex following intratympanic gentamicin for Meniere’s disease［J］.J Assoc Res Otolaryngol，2002，3（4）：430-443.

［2］Park HJ，Migliaccio AA，Della Santina CC，et al.Search-coil headthrust and caloric tests in Ménière’s disease［J］.Acta Otolaryngol，2005，125（8）：852-857.

［3］Hess K，Baloh RW，Honrubia V，etal.Rotational testing in patients with bilateral peripheral vestibular disease［J］.Laryngoscope，1985，95（1）：85-88.

［4］Young YH，Nomura Y，Okuno T，et al.Electronystagmographic recordings of guinea pig animalmodels in experimental otology［J］.Acta Otolaryngol Suppl，1991，481：534-535.

［5］Cremer PD，Halmagyi GM，Aw ST，et al.Semicircular canal plane head impulses detectabsent function of individual semicircular canals［J］.Brain，1998，121：699-716.

［6］Hallpike CS，Cairns H.Observations on the pathology of Meniere′s syndrome［J］.JLaryngol Otol，1938，53：625-655.

［7］Kimura RS，SchuknechtHF.Membranous hydrops in the inner ear of the guinea pig after obliteration of the endolymphatic sac［J］.Pract Otorhinolaryngol，1965，27（6）：343-354.

［8］王宜南，劉兆華.用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)研究膜迷路積水［J］.中華耳鼻咽喉科雜志，1996，31（2）：139-141.

［9］A lbers FW，Veldman JE，Huizing EH.Early hair cell loss in experimental hydrops［J］.Ann Otol Rhinol Laryngol，1987，96（3）：282-285.

［10］Albers FW，de G root JC，Veldman JE，et al.Ultrastructure of the stria vascularis and Reissner′s membrane in experimental hydrops［J］.Acta Otolaryngol，1987，104（3/4）：202-210.

［11］韓紅蕾，張連山.醋酸去氨加壓素誘導(dǎo)豚鼠膜迷路積水［J］.中國聽力語言康復(fù)科學(xué)雜志，2007，1（1）：14-15.

［12］Sperling NM，Paparella MM，Yoon TH，et al.Symptomatic versus asymptomatic endolymphatic hydrops：a histopathologic comparison［J］.Laryngoscope，1993，103（3）：277-285.

［13］Hamid MA.Contemporary neurovestibular physiologic assessment［J］.Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg，2000，8（5）：391-397.

［14］李漫娜，殷善開，黃艷艷，等.內(nèi)淋巴積水模型豚鼠前庭及耳蝸功能的動(dòng)態(tài)變化［J］.中國眼耳鼻喉科雜志，2001，1（3）：65-71.

［15］Boleas-Aguirre M，Migliaccio AA，Carey JP.Vestibulo-oculomotor reflex recording using the scleral search coil technique.Review of peripheral vestibular disorders［J］.Acta Otorrinolaringol Esp，2007，58（7）：321-326.

［16］陳良，賀明，王武慶.慶大霉素對(duì)水平半規(guī)管壺腹嵴的高頻旋轉(zhuǎn)感受功能損失及其形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)［J］.生理學(xué)報(bào)，2009，61（6）：559-566.

［17］Lasker DM，Han GC，Park HJ，et al.Rotational responses of vestibular-nerve afferents innervating the semicircular canals in the C57BL/6 mouse［J］.J Assoc Res Otolaryngol，2008，9（3）：334-348.

［18］Merchant SN.A method for quantitative assessment of vestibular otopathology［J］.Laryngoscope，1999，109（10）：1560-1569.

（本文編輯 楊美琴）

試題5.答案：B。脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞瘤通常位于視盤上或圍繞視盤，單側(cè)發(fā)生，屬于一種良性腫瘤，但有轉(zhuǎn)變成惡性的可能?；颊叨鄶?shù)無癥狀，偶爾有因腫瘤生長或視網(wǎng)膜血管梗阻而致視力下降。

試題6.答案：D。擬眼組織胞漿菌病的三聯(lián)征包括：穿鑿樣的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜瘢痕，CNV所致的黃斑滲出性病變和視盤周圍脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮灶。

Research of endolymphatic hydrops induced frequency sensation function damage of the periphery vestibule in guinea pigs

SUN Qin，WANGWu-Qing. Department of Otorhinolaryngology，Eye Ear Nose and Throat Hospital of Fudan University，Shanghai 200031，China

WANGWu-qing，Email：wangwuqing＠eent.shmu.edu.cn

ObjectiveTo explore the frequency sensation function in guinea pigs with endolymphatic hydrops.MethodsForty guinea pigs were randomly divided into four groups（group A，B，C and control group，n＝10）.The animals of group A，B and Cweremade asmodels of endolymphatic hydrops by resection of the rightendolymphatic sac.Electronystagmography（ENG）evoked by ice water and rotation test at normal time（control group）or postoperatively after 2 weeks（group A），4 weeks（group B）and 8 weeks（group C）were performed respectively.Nystagmus frequency and duration were recorded.The animals of each group were sacrificed at each time，respectively.The temporal bones were sectioned and stained.ResultsIn ENG examination after ice water stimulation，weak nystagmus was observed in four guinea pigs of group A.Therewas no response in the animals of other treated groups.No significant differenceswere found in the nystagmus speeds of the ENG waves between the left and right in each group（P＞0.05）.There were no hydrops in the control group.There were different degrees of distension of Reissnermembrane to the scala vestibuliafter operation.The longer the time after operation，the more apparent the Reissner membrane was toward to the scala vestibuli.ConclusionsEndolymphatic hydrops selectively influence low frequency sensation function of the periphery vestibule.The posterior cranial fossa approach to obstruct endolymphatic sac is amethod of establishing animalmodel of endolymphatic hydrops.（Chin JOphthalmol and Otorhinolaryngol，2014，14：214-217）

Endolymphatic hydrops；Periphery vestibule organs；Frequency；Electronystagmography； Guinea pigs

2014-03-28）

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200031

王武慶（Email：wangwuqing＠eent.shmu.edu.cn）