陳雅瑩 陳科全 陳學(xué)清

乳鏈菌腫瘤特異性標(biāo)記載體的構(gòu)建及初步驗證

陳雅瑩 陳科全 陳學(xué)清

目的利用乳鏈菌穿梭載體構(gòu)建腫瘤特異標(biāo)記表達系統(tǒng)，為腫瘤特異性口服疫苗的研究開辟一個新領(lǐng)域。方法采用體外基因拼裝的方法得到PEG-3啟動子，經(jīng)酶切鑒定并測序驗證。然后利用基因克隆技術(shù)，將PEG-3啟動子、EGFP、Poly A亞克隆到乳鏈菌載體pTRKH2中，成功得到腫瘤特異標(biāo)記質(zhì)粒pTR-peg3-egfp。最后，轉(zhuǎn)染腫瘤及非腫瘤細胞初步驗證其腫瘤特異性標(biāo)記能力。結(jié)果通過PCR基因拼裝得到460bp左右目的片段，測序結(jié)果與設(shè)計完全一致。獲得了腫瘤特異標(biāo)記的乳鏈菌穿梭質(zhì)粒pTR-peg3-egfp，并在細胞水平得到初步驗證。結(jié)論PEG-3啟動子介導(dǎo)的乳鏈菌穿梭質(zhì)粒具有腫瘤特異性，這一實用新穎的系統(tǒng)將為研究乳鏈菌疫苗應(yīng)用于腫瘤標(biāo)記及靶向治療奠定基礎(chǔ)。

PEG-3啟動子；乳鏈菌；基因治療；腫瘤

惡性腫瘤已成為威脅人類健康的最嚴(yán)重疾病之一，隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機理研究的深入，學(xué)者們著手從基因水平進行治療。表達靶向性差和表達效率低是限制基因治療進一步應(yīng)用的主要障礙。因此，構(gòu)建高效的靶向性載體具有重要意義。自從Emdad等[1]發(fā)現(xiàn)的PEG-3（progression elevated gene-3）啟動子能特異性識別多種惡性腫瘤細胞，而不對正常細胞產(chǎn)生影響之后，國內(nèi)外開展了許多關(guān)于PEG-3的研究，表明在前列腺癌[2]，乳腺癌[3]、胰腺癌[4]、惡性膠質(zhì)瘤[5]、神經(jīng)母細胞瘤[6]、黑色素瘤[7]、腎癌[8]、肝癌[9]等惡性腫瘤均有靶向作用。PEG-3作為理想的腫瘤特異性啟動子為腫瘤的診斷及基因治療提供了新思路。目前，國內(nèi)外關(guān)于PEG-3介導(dǎo)外源性基因表達的研究大多采用病毒載體，具有潛在危險性。乳鏈菌（Streptococcus lactis;Lactococcus lactis）作為一種安全有效的非病毒載體，被大量用于表達多種生物多肽或蛋白及口服疫苗的研究。我們擬利用乳鏈菌穿梭載體構(gòu)建腫瘤特異性標(biāo)記系統(tǒng)，為將來乳鏈菌疫苗應(yīng)用于腫瘤的標(biāo)記及靶向治療奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料

1.生物材料

大腸桿菌DH5a感受態(tài)、PMD20-T載體購自Takara生物公司；pEGFP-C2質(zhì)粒由本實驗室保存；質(zhì)粒pTRKH2由美國Klaenhammer TR教授惠贈。

2.質(zhì)粒和試劑

Taq 2×PCR mix、DNA Ladder為東盛生物公司產(chǎn)品；高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase及所用限制性內(nèi)切酶為Takara生物公司產(chǎn)品，T4連接酶購自NEB公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin LTX &Plus購自invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒及PCR凝膠回收試驗盒為Axygen公司產(chǎn)品。寡核苷酸引物及測序于生工生物有限公司進行。其它試劑均為國產(chǎn)化學(xué)分析純。

二、方法

1.體外拼裝peg-3啟動子

Internet在線進入DNAWORKS程序，將PEG-3堿基序列輸入，該程序自動將目的基因序列設(shè)計成18條相互重疊的cDNA寡核苷酸片段（P1-P18）。拼裝引物設(shè)計、PCR反應(yīng)參照文獻的方法[10]。取上述拼接產(chǎn)物加A尾后用PMD20-T試劑盒進行TA克隆。方法按takara公司提供的說明書進行。PEG-3陽性克隆產(chǎn)物經(jīng)酶切鑒定后送生工生物公司測序。

2.載體pTR-peg3-egfp的構(gòu)建

首先以pEGFP-C2為模板，設(shè)計特異性引物把EGFP、Poly A進行TA克隆。經(jīng)測序驗證無誤后將EGFP、Poly A片段亞克隆至乳鏈菌穿梭質(zhì)粒pTRKH2上。最后將PEG-3陽性克隆產(chǎn)物及上述含有EGFP、Poly A的pTRKH2質(zhì)粒分別加入Xba I和SacI進行雙酶切，切膠回收后進行連接，16℃過夜。大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，加入10 μL連接產(chǎn)物，冰上放置30 min，42℃熱休克90 s，然后迅速置于冰上3 min，加入800 μL LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床溫和搖振（220 r/rain）1 h復(fù)蘇細菌，吸取200 μL菌液用鋪菌棒均勻涂布于含紅霉素（終濃度150 μg/ mL）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)16 h。分別挑取LB平板上生長的數(shù)個單菌落，加入至含紅霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基37℃220 r/min搖振16 h，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，并命名為pTR-peg3-egfp（見圖1）。

3.pTR-peg3-egfp質(zhì)粒腫瘤特異性的初步驗證

以肝癌細胞HepG2及正常肝細胞L02為代表進行初步驗證。HepG2、L02細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天將HepG2和L02細胞按1× 104/孔種于24孔板中，用無抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，換無血清培養(yǎng)液，用脂質(zhì)體（Lipofectamin LTX &Plus）轉(zhuǎn)染，方法按產(chǎn)品說明書進行。pTR-peg3-egfp質(zhì)粒及pEGFP-C2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2、L02細胞，每孔加入質(zhì)粒DNAlug，均各做3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染6h后換掉轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。

圖1 腫瘤特異性乳鏈菌載體構(gòu)建示意圖。PEG-3：腫瘤特異性啟動子；egfp：增強型綠色熒光蛋白；polyA:多聚腺苷酸加尾信號。

結(jié)果

一、PEG-3啟動子拼裝

將第1次PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)有460 bp左右的DNA目的片段，但目的DNA片段后有拖尾狀的其它非目的片段產(chǎn)生；產(chǎn)物稀釋100倍后，再用第1和第16條引物，以同樣條件進行PCR反應(yīng)，形成一條明顯的目的條帶（見圖2），目的片段大小與設(shè)計的預(yù)期片段相符合。PEG-3啟動子TA克隆產(chǎn)物經(jīng)酶切鑒定后送生工生物公司測序與原設(shè)計序列完全相符。

PEG-3測序結(jié)果：下劃線為酶切位點Xba I和SacI。

tctagaggatctactagtcatatggattgggtaccgggccccccgtcgacct gatgaagttggcgtgcttgctcaaaagttctgcgagattgacggctctctgg atttgagccaaggacacgcctgggaagccacggtgacctcacaaggccc ggaatctccgcgagaatttcagtgttgttttcctctctccacctttctcagggac ttccgaaactccgcctctccggtgacgtcagcatagcgctgcgtcagactataaactcccgggtgatcgtgttggcgcagattgactcagttcgcagcttgtgg aagattacatgcgagaccccgcgcgactccgcatccctttgccgggacag cctttgcgacagcccgtgagacatcacgtccccgagccccacgcctgagg gcgacatgaacgcgctggccttgagagcaatccggacccacgatcgctttt ggcaaaccgaaccggacaagcttaatcggatccccgggtaccgagctc

二、載體pTR-peg3-egfp酶切鑒定結(jié)果

整個載體上共有三個EcorⅠ位點，在載體多克隆位點的前后各有一EcorⅠ故能把我們的插入片段都切下來，載體復(fù)制子P15A ori前亦有一EcorⅠ，故pTR-peg3-egfp經(jīng)EcorⅠ酶切可形成三條帶（見圖3），其中略大于1500bp的條帶為整個多克隆位點（含插入片段PEG-3、egfp、poly A）。證實載體pTR-peg3-egfp構(gòu)建成功。

圖2 PEG-3第2次PCR擴增后電泳圖（泳道1為takara公司DL2000marker）

圖3 質(zhì)粒pTR-peg3-egfp酶切鑒定圖（泳道1為takara公司DL5000marker）

三、質(zhì)粒pTR-peg3-egfp的轉(zhuǎn)染結(jié)果

以肝癌細胞HepG2及正常肝細胞L02為代表進行初步驗證。CMV啟動子沒有腫瘤特異性，具有CMV啟動子的pEGFP-C2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2和L02細胞均能表達熒光；PEG-3啟動子有腫瘤特異性，用pTR-peg3-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細胞HepG2表達熒光，轉(zhuǎn)染正常肝細胞L02沒有表達熒光（見圖4）。

討論

腫瘤基因治療當(dāng)前的重點在于建立靶向性好和表達效率高的載體系統(tǒng)。腫瘤特異性啟動子可驅(qū)動目的基因?qū)崿F(xiàn)腫瘤的靶向治療。前列腺特異性抗原（prostate specific antigen,PSA）啟動子、mucin-1啟動子、CEA（carcinoembryonic antigen）等腫瘤特異性啟動子只針對有限組織起源的腫瘤細胞，且轉(zhuǎn)錄活性較弱，因而運用受到了限制。針對廣泛腫瘤特征的PEG-3啟動子能特異性識別多種惡性腫瘤細胞，而不對正常細胞產(chǎn)生影響，具有很好的靶向性。PEG-3啟動子可直接影響腫瘤細胞所特有的轉(zhuǎn)錄因子，表達水平高，無需添加二步放大系統(tǒng)，活性與組成性激活SV40啟動子相當(dāng)[11]。因此PEG-3無疑是應(yīng)用于基因診斷、轉(zhuǎn)移監(jiān)測乃至基因治療最有前景的腫瘤特異性啟動子。

圖4 質(zhì)粒pTR-peg3-egfp的轉(zhuǎn)染結(jié)果（A、B分別為明場及熒光場下pEGFP-C2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02細胞表現(xiàn)；C、D分別為明場及熒光場下pTR-peg3-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02細胞表現(xiàn)；E、F分別為明場及熒光場下pEGFP-C2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞表現(xiàn)；G、H分別為明場及熒光場下pTR-peg3-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞表現(xiàn)）

國內(nèi)外關(guān)于PEG-3介導(dǎo)外源性基因表達的研究大多采用病毒載體。雖然這種方法能使基因高水平導(dǎo)入和表達，但所引發(fā)的宿主炎性免疫反應(yīng)較強，生產(chǎn)成本亦甚高，最重要的是其可能通過重組產(chǎn)生致病的野生型病毒具有潛在危險性。其實，研究人員很早就建立了多種由細菌介導(dǎo)外源性質(zhì)粒DNA進入哺乳動物細胞的方法[12]，有人稱之為Bactofec－tion[13]（“菌感”）。乳鏈菌是一種對人體無害，安全的細菌（generally regarded as safe,GRAS），被廣泛應(yīng)用于乳制品工業(yè)、生物多肽或蛋白及口服疫苗的研究[14]。這一食品級細菌無疑是作為“菌感”菌的最佳選擇。本實驗成功構(gòu)建了PEG-3啟動子驅(qū)動的乳鏈菌穿梭載體，并驗證了其腫瘤靶向標(biāo)記能力，為進一步研究乳鏈菌疫苗應(yīng)用于腫瘤標(biāo)記及靶向治療奠定基礎(chǔ)。

1Emdad L,Sarkar D,Su ZZ,et al.Progression elevated gene‐3 (PEG‐3)induces pleiotropic effects on tumor progression:Modulation of genomic stability and invasion.J Cell Physiol,2005,202(1): 135-146.

2Sarkar D,Lebedeva IV,Su Z,et al.Eradication of therapy-resistant human prostate tumors using a cancer terminator virus.Cancer Res, 2007,67(11):5434-5442.

3Sarkar D,Su Z,Vozhilla N,et al.Dual cancer-specific targeting strategy cures primary and distant breast carcinomas in nude mice. Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(39):14034-14039.

4Chan I,Lebedeva I V,Su ZZ,et al.Progression elevated gene‐3 promoter(PEG‐Prom)confers cancer cell selectivity to human polynucleotide phosphorylase(hPNPaseold‐35)‐mediated growth suppression.J Cell Physiol,2008,215(2):401-409.

5Hamed H A,Yacoub A,Park M A,et al.Histone Deacetylase Inhibitors Interact with Melanoma Differentiation Associated-7/Interleukin-24 to Kill Primary Human Glioblastoma Cells.Mol Pharmacol,2013,84(2):171-181.

6Van Maerken T,Sarkar D,Speleman F,et al.Adenovirus‐mediated hPNPaseold‐35 gene transfer as a therapeutic strategy for neuroblastoma.J Cell Physiol,2009,219(3):707-715.

7Sarkar D,Su ZZ,Park ES,et al.A cancer terminator virus eradicates both primary and distant human melanomas.Cancer Gene Ther, 2008,15(5):293-302.

8Hamed HA,Das SK,Sokhi UK,et al.Combining histone deacetylase inhibitors with MDA-7/IL-24 enhances killing of renal carcinoma cells.Cancer Biol Ther,2013,14(11):1039-1049.

9Zhang J,Gan Y,Gu J,et al.Potent anti-hepatoma efficacy of HCCS1 via dual tumor-targeting gene-virotherapy strategy.Oncol Rep,2008,20(5):1035-1040.

10陳學(xué)清,王亞東,孫勇,等.體外拼裝凋亡素基因.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2005,25(2):195-197.

11 Hyo-eun CB,Gabrielson KL,Laterra J,et al.Tumor-specific imaging through progression elevated gene-3 promoter-driven gene expression.Nat Med,2011,17(1):123-129.

12 Grillot-Courvalin C,Goussard S,Huetz F,et al.Functional gene transfer from intracellular bacteria to mammalian cells.Nat Biotechnol,1998,16(9):862-866.

13 Akin D,Sturgis J,Ragheb K,et al.Bacteria-mediated delivery of nanoparticles and cargo into cells.Nat Nanotechnol,2007,2(7):441-449.

14 Ravnikar M,譒trukelj B,Obermajer N,et al.Engineered lactic acid bacterium Lactococcus lactis capable of binding antibodies and tumor necrosis factor alpha.Appl Environ Microbiol,2010,76(20): 6928-6932.

Construction and identification of the tumor-specific imaging system with the recombinant lactococcus lacti shuttle vector

CHEN Ya-ying,CHEN Ke-quan,CHEN Xue-qing.Department of Gastroenterology, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,No.151,Yanjiang Road,Guangzhou 510120, Guangdong,China

Objective The aim of this study is to construct a tumor-specific imaging system with the shuttle vector of lactococcus lacti which will open a new field for the study of tumor-specific oral vaccine. Methods The PEG-3 promoter was constructed by means of PCR base gene assembly,and conformed by enzyme digestion and DNA sequencing.Then,constructed recombinant pTR-peg3-egfp(shuttle plasmid)carrying the PEG-3 promoter enhanced green fluorescent protein and Poly A tail.Finally,the ability of tumor-specific imaging in the means of in vitro transfection was validated.Results A 460 bp purpose fragment obtained by PCR gene splicing agreed exactly with the design.The tumor specific lactococcus lacti plasmid pTR-peg3-egfp was successfully constructed,and also got a preliminary validation on cellular level.Conclusion Lactococcus lacti vector with PEG-3 promoter could specifically recognize tumor cell.This utility,new lactococcus lacti system can lay a solid foundation for both cancer imaging and tumor-specific gene therapy.

PEG-3 promoter;Lactococcus lacti;Gene therapy;Neoplasms

2014-01-21）

（本文編輯：白楊）

10.3961/j.issn.1672-2159.2014.04.002

510120廣州醫(yī)學(xué)大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科

陳學(xué)清，E-mail：chenxq@vip.163.corn

國家自然科學(xué)基金項目（No：81250012）