鄧銀芝 張長江 王晶晶 賀建華

G3BP1和G3BP2蛋白在早期胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

鄧銀芝1張長江2王晶晶3賀建華1

目的觀察早期胃癌組織中GTP酶激活蛋白SH3功能區(qū)結(jié)合蛋白G3BP1和G3BP2的表達(dá)變化并探討其意義。方法選擇早期胃癌組織89例和正常對(duì)照組織35例，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)兩組G3BP1蛋白和G3BP2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果早期胃癌組和正常組G3BP1的陽性率分別為87.64%和60.00%，G3BP2陽性率分別為86.51%和54.28%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，0.000）；早期胃癌G3BP1和G3BP2的表達(dá)均與幽門螺桿菌感染相關(guān)（P=0.000）；早期胃癌組織中G3BP1與G3BP2表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.252，P=0.017）。結(jié)論早期胃癌組織中G3BP1和G3BP2呈高表達(dá)，可能與幽門螺桿菌感染緊密相關(guān)，兩指標(biāo)異常表達(dá)可能在早期胃癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。

早期胃癌；G3BP1；G3BP2；免疫組織化學(xué)

1996年P(guān)arker等[1]由中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞首次克隆一種能夠與Ras-GAPSH3結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的蛋白，后來此蛋白被命名為G3BP。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)人G3BP有兩個(gè)亞型，即G3BP1和G3BP2。正常情況下G3BP可以在胚胎和成熟組織中廣泛表達(dá)，而且在不同部位、不同病程的腫瘤組織中表達(dá)均增高[2]。這提示G3BP可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著不容忽略的作用。隨著近年來內(nèi)鏡技術(shù)的不斷進(jìn)步，早期胃癌的臨床檢出率越來越高。本文通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)早期胃癌組織中的G3BP1和G3BP2蛋白的表達(dá)，探討二者與早期胃癌生物學(xué)行為之間的關(guān)系，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析二者在早期胃癌組織中的表達(dá)是否有關(guān)聯(lián)性，為探討早期胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和G3BPs的功能提供理論根據(jù)。

材料和方法

一、臨床資料

入選對(duì)象為我院和湖北民族學(xué)院民大醫(yī)院2011年2月至2013年9月住院患者，其中早期胃癌符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，89例早期胃癌，其中男40例，女49例；年齡18～89歲，平均年齡（56.36±16.27）歲，年齡<60歲者43例，大于60歲者46例；發(fā)生部位：胃竇部54例，非胃竇部為35例；幽門螺桿菌感染57例，非幽門螺桿菌感染32例；管狀腺癌32例，非管狀腺癌57例。正常對(duì)照組35例，男20例，女15例；年齡22～65歲，平均年齡（51.27±9.54）歲，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。取材前征得患者同意。

二、主要試劑

鼠抗人G3BP1單克隆抗體（Ac-81940）購自美國Sigma生物技術(shù)有限公司；兔抗人G3BP2多克隆抗體購自美國Santa Cruz生物技術(shù)股份有限公司，北京中衫金橋生物公司兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（PV-9000）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛緩沖液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，然后每例石蠟標(biāo)本切至4～5 μm厚，經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。采用免疫組織化學(xué)方法，嚴(yán)格按照PV-9000試劑盒說明書進(jìn)行操作。G3BP1和G3BP2一抗的工作濃度分別為1∶200、1∶300。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

四、結(jié)果判斷

觀察陽性反應(yīng)采用雙盲法，并由兩位醫(yī)師獨(dú)立觀察每張切片后一起做出判斷。結(jié)果判斷：每例隨機(jī)選取不重復(fù)的5個(gè)視野在高倍鏡視野觀察，根據(jù)陽性表達(dá)部位的染色強(qiáng)度及細(xì)胞數(shù)綜合評(píng)價(jià)。陰性胞漿基本不著色0分，顏色淺者為弱陽性為1分，棕黃色顆粒2分，顏色深者為3分。細(xì)胞陽性表達(dá)數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無著色細(xì)胞；1分，陽性細(xì)胞數(shù)25%；2分，陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%；3分，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%。二者評(píng)分結(jié)果相乘，以乘積作為最后得分可以作為判斷結(jié)果的依據(jù)。其中0分為（－），1分和2分為（+），3分和4分為（++），6分和9分為（+++）。得分后將0～2分定性判為陰性，其余3分以上判為陽性結(jié)果。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，G3BP1或G3BP2蛋白表達(dá)與早期胃癌臨床病理特征的相互關(guān)系用χ2檢驗(yàn)，不適用χ2的用Fisher確切概率法; G3BP1和G3BP2蛋白表達(dá)的關(guān)系分析應(yīng)用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、G3BP1蛋白和G3BP2蛋白在早期胃癌以及正常胃組織中表達(dá)情況

89例早期胃癌患者中，78例G3BP1蛋白和77例G3BP2蛋白表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為87.64%和86.51%。其中G3BP1蛋白表達(dá)水平（－）11例，（+）6例，（++）29例，（+++）43例；G3BP2蛋白表達(dá)水平（－）12例，（+）6例，（++）18例，（+++）53例。而在35例正常大腸組織中G3BP1蛋白和77例G3BP2蛋白二者陽性表達(dá)率分別為60.00%和54.28%；病例組和對(duì)照組G3BP1蛋白和G3BP2蛋白陽性表達(dá)兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，0.000），見圖1。

二、早期胃癌組織中G3BP1蛋白和G3BP2蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

G3BP1蛋白和G3BP2蛋白的表達(dá)與早期胃癌患者是否感染幽門螺桿菌緊密相關(guān)（P=0.047，0.014），而與患者年齡，性別，癌變部位以及病理分型無關(guān)（P>0.05），見表1。

表1 G3BP1和G3BP2蛋白在早期胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

三、胃癌組織中G3BP1蛋白和G3BP2蛋白表達(dá)之間的關(guān)系

G3BP1蛋白和G3BP2蛋白陽性表達(dá)率的關(guān)系經(jīng)關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)表明二者之間呈正相關(guān)性（rs=0.252，P=0.017，見表2）。

圖1 G3BP1蛋白和G3BP2蛋白陽性表述情況

表2 早期胃癌組織中G3BP1蛋白和G3BP2蛋白的關(guān)系

討論

現(xiàn)已明確Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞骨架構(gòu)建、惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等多種極為重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮作用[5-6]。Ras蛋白有活化狀態(tài)和非活化狀態(tài)，生理情況下處于非活化狀態(tài)。當(dāng)受到外界刺激時(shí)，與Ras結(jié)合的GDP轉(zhuǎn)變成GTP，Ras構(gòu)象發(fā)生改變變?yōu)榛罨癄顟B(tài)。G3BP已被證實(shí)可以與GAP的SH3功能區(qū)牢固結(jié)合，當(dāng)ras呈激活狀態(tài)時(shí)，G3BP與GAP的SH3功能相結(jié)合形成GAP-G3BP復(fù)合物發(fā)揮生物效應(yīng)[7-9]。近年來G3BP與腫瘤的關(guān)系得到廣泛研究，寧鈞宇等[10]發(fā)現(xiàn)肺癌﹑乳腺癌﹑結(jié)腸癌以及胃癌等臨床腫瘤標(biāo)本組織中G3BP普遍表達(dá)陽性。劉金耿等[11]在研究G3BP在食管鱗癌組織中表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)G3BP的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

早期胃癌是常見的消化道疾病，目前認(rèn)為早期胃癌的發(fā)生與幽門螺桿菌感染緊密相關(guān)。鑒于G3BP在細(xì)胞增殖、分化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，本實(shí)驗(yàn)旨在研究早期胃癌組織中G3BP1和G3BP2蛋白表達(dá)變化以及對(duì)早期胃癌生物學(xué)行為的影響。本實(shí)驗(yàn)研究表明早期胃癌組和正常組G3BP1的陽性率分別為87.64%和60.00%，G3BP2陽性率分別為86.51%和54.28%，且兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在研究G3BP1和G3BP2蛋白在早期胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系時(shí)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)患者年齡，性別，癌變部位以及病理分型無關(guān)而與患者是否感染幽門螺桿菌相關(guān)相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)尚未見報(bào)道，其具體機(jī)制有待研究。從而提示幽門螺桿菌陽性且組織G3BP1和G3BP2蛋白陽性率高者患早期胃腸癌可能性大。研究還發(fā)現(xiàn)G3BP1蛋白和G3BP2蛋白陽性表達(dá)率的關(guān)系經(jīng)關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)表明二者之間呈正相關(guān)性（rs=0.758，P=0.000），提示G3BP1和G3BP2異常表達(dá)可能呈協(xié)同作用。但該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能受樣本病情配對(duì)以及樣本量大小等因素影響，有待進(jìn)一步研究。

總之，早期胃癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜的過程。本實(shí)驗(yàn)僅僅從蛋白水平探討了G3BP在早期胃癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系。為了進(jìn)一步驗(yàn)證G3BP在早期胃癌組織的作用以及對(duì)其生物學(xué)行為的影響，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)。

1Parker F,Maurier F,Delumeau I,et al.A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.Mol Cell Biol,1996,16(6): 2561-2569.

2Guitard E,Parker F,Millon R,et al.G3BP is overexpressed in human tumors and promotes S phase entry.Cancer Lett,2001,162 (2):213-221.

3胡祥.日本《胃癌治療指南》(第3版)解讀.中國實(shí)用外科雜志, 2010,30(1):25-30.

4黃方,張勇,黃建強(qiáng),等.鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤中G3BP Stathmin的表達(dá)及意義.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011,49(11):120-124.

5邢傳平,劉斌,董亮,等.免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果的判斷方法.中華病理學(xué)雜志,2001,30(4):318.

6Zenonos K,Kyprianou K.RAS signaling pathways,mutations and their role in colorectal cancer.World J Gastrointest Oncol,2013,5 (5):97-101.

7Wang X,Zheng Y,Fan Q,et al.Effect of blocking Ras signaling pathway with K-Ras siRNA on apoptosis in esophageal squamous carcinoma cells.J Tradit Chin Med,2013,33(3):361-366.

8Clark GJ,Quilliam LA,HisakaMM,et al.Differential antagonis m of Ras biological activity by catalytic and Src homology domains of Ras GTPase activati on protein.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90 (11):4887-4891.

9Martin GA,YataniA,Clark R,et al.GAP domains res ponsible for ras p21-dependent inhibiti on of muscarinic atrial K+channe currents.Science,1992,255(5041):192-194.

10寧鈞宇,由江峰,裴斐,等.G3BP單克隆抗體制備及G3BP在腫瘤組織中表達(dá)的檢測(cè).中華病理學(xué)雜志,2005,34(4):215-219.

11劉金耿,張惠中,魏益平,等.食管鱗癌G3BP和骨橋蛋白的表達(dá)及其對(duì)患者預(yù)后的影響.中華胃腸外科雜志,2007,10(1):73-76.

Expression of G3BP1 and G3BP2 proteins in early gastric cancer and their clinical significances

DENG Yin-zhi1,ZHNG Chang-jiang2,WANG Jin-jin3,HE Jian-hau1.1)Department of Gastroenterology,Central Hospital of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture,Enshi,Hubei 445000,China;2)Department of cardiovascular,Central Hospital of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture,Enshi,Hubei 445000,China;3)Department of Gastroenterology,Affiliated Min Da Hospital of Hubei Institute for Nationalities School of Medicine.Corresponding author:HE Jian-hau,E-mail:hjhlsf@126.com

Objective To observe the expression and significances of Ras-GTPase-activating protein SH3 domain binding protein G3BP1 and G3BP2 in early gastric cancer.Methods The expression of G3BP1 and G3BP2 proteins both in 89 cases of early gastric cancer and 35 cases of normal tissues(control group) were detected by immunohistochemistry．Results The positive rates of G3BP1 in gastric cancer group and control group were 87.64%and 60.00%respectively,the positive rates of G3BP2 were 86.51%and 54.28%respectively,and there were significantly different between two groups(P=0.000,0.000,respectively).Both the degree of G3BP1 and G3BP2 expression were correlated with H.pylori infection(P=0.000).Spearman relative analysis showed that the degree of G3BP1 expression in gastric cancer was correlated positively with the degree of G3BP2 expression(rs=0.252，P=0.017).ConclusionG3BP1 and G3BP2 proteins are highly expressed in early gastric cancer,and their abnormal expression may play important roles in the development and progress of gastric ulcer.

Early gastric cancer;G3BP1;G3BP2;Immunohistochemistry

2013-11-12）

（本文編輯：何美蓉）

10.3961/j.issn.1672-2159.2014.04.001

1 445000恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院消化內(nèi)科；2 445000恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院內(nèi)科心血管病中心；3 445000湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院

賀建華，E-mail：hjhlsf@126.com