王曉山 張占學(xué) 林 林 李 濤 邱少凡 張海強 宋偉慶

miR-126在人結(jié)腸癌細胞中的表達及其對結(jié)腸癌細胞耐藥性的影響

王曉山1張占學(xué)2林 林2李 濤2邱少凡2張海強2宋偉慶2

目的探討miR-126在人結(jié)腸癌細胞中的表達及其對結(jié)腸癌細胞的耐藥性影響。方法采集我院腫瘤科2010年7月至2013年8月收治的45例結(jié)腸癌患者的癌組織、癌旁組織及30例同期體檢健康對象的正常結(jié)腸組織（正常組織），采用熒光PCR檢測miR-126表達水平；體外培養(yǎng)HCT116細胞，通過轉(zhuǎn)染抑制序列抑制miR-126的表達，檢測抑制HCT116細胞miR-126的表達對結(jié)腸癌細胞耐藥性的影響。結(jié)果結(jié)腸癌組織的miR-126陽性表達率顯著低于癌旁組織、正常組織（P<0.05）；癌旁組織的miR-126陽性表達率低于正常組織但差異不顯著（P>0.05）；miR-126表達在年齡、性別、分化程度、腫瘤大小間差異不顯著（P>0.05），不具統(tǒng)計學(xué)意義；miR-126表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期、臨床分期具有顯著的相關(guān)性，且miR-126表達水平在各個層之間差異顯著（P<0.05）；在0、5、10、20 mg/L的奧沙利鉑培養(yǎng)基中，miR-126陽性組的癌細胞活性（吸光度值）均顯著低于miR-126陰性組且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論結(jié)腸癌組織中的miR-126陽性表達率較低，癌細胞組織中的miR-126陽性表達有利于降低癌細胞的耐藥性，有利于對結(jié)腸癌的治療效果。

miR-126；結(jié)腸癌；細胞的轉(zhuǎn)移；耐藥性；增值能力

資料與方法

一、一般資料

本研究選取我院腫瘤科2010年7月至2013年8月收治的45例結(jié)腸癌患者及體檢中心提供的30例正常研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)腸癌的診斷均經(jīng)過術(shù)前病理學(xué)及術(shù)后病理組織活檢確診；②患者術(shù)前均未接受過放療和化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)治療前接受過放療或化療的患者，未經(jīng)過病理組織學(xué)檢查確診的患者。

本次研究共納入75例研究對象，結(jié)腸癌患者45例，男性27例、女性18例，年齡47～72歲，平均年齡（58.4±10.5）歲；體檢健康對象30例，男性18例、女性12例，年齡44～72歲，平均年齡（55.3± 9.7）歲；結(jié)腸癌患者和健康對象的年齡、性別等一般資料比較差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)

HCT116細胞（高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞株）培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于95% O2、5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，細胞鋪滿瓶底80%～90%時進行常規(guī)傳代。采用上海吉瑪公司化學(xué)合成的miR-126的抑制序列和陰性對照序列轉(zhuǎn)染HCT116細胞，具體序列如下：miR-126的抑制序列：5′-CGCAUUAU UACUCACGGUACGA-3′，陰性對照序列：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′[3]。細胞轉(zhuǎn)染步驟：轉(zhuǎn)染前一天，將長至80%融合的HCT116細胞傳代至6孔板，1×108個/孔，轉(zhuǎn)染當(dāng)日嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑lip2000試劑盒（invitrogen公司）說明書進行，轉(zhuǎn)染后24 h，分別將轉(zhuǎn)染兩種序列的細胞（標(biāo)記為miR-126陰性細胞和miR-126陽性細胞）傳代至96孔板中，10 000個細胞/孔，分別用含有0、5、10、20 mg/L的奧沙利鉑培養(yǎng)基對兩種癌細胞進行培養(yǎng)，其中每個濃度設(shè)5個平行孔，培養(yǎng)72 h使用MTT實驗檢測細胞的吸光度。

2.RT-PCR

取待測結(jié)腸癌患者的病變組織、癌旁組織和正常組織100 g加入1 mL Trizol試劑（invitrogen公司），勻漿器勻漿，按照按RNeasy mini kit RNA試劑盒（TAKARA公司）說明書純化總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，合成引物：上游：5′-GGGGTCGTACCGTGAGT-3′，下游：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，循環(huán)參數(shù)為：95℃變性5 min，95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，20 s；78℃，20 s（收集熒光），共40個循環(huán)。

3.分組方法

將我院腫瘤科2010年7月至2013年8月收治的45例結(jié)腸癌患者的癌組織、癌旁組織及30例同期體檢健康對象的正常結(jié)腸組織（正常組織）；同時根據(jù)實驗結(jié)果將癌組織根據(jù)miR-126表達情況分為miR-126陽性組和miR-126陰性組，兩組標(biāo)本患者的年齡、性別等一般資料比較差異不顯著（P> 0.05）。

三、統(tǒng)計方法

所有收集數(shù)據(jù)錄入Excel2003，在spss10.0中進行統(tǒng)計分析。計量資料以（x±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗、計數(shù)資料以%表示，采用卡方檢驗、非參數(shù)檢驗，檢驗水準(zhǔn)取α=0.05。

結(jié)果

一、不同結(jié)腸組織的miR-126陽性表達情況

結(jié)腸癌組織的miR-126陽性表達率顯著低于癌旁組織、正常組織（P<0.05）；癌旁組織的miR-126陽性表達率低于正常組織但差異不顯著（P> 0.05）；詳見表1。

二、miR-126表達與結(jié)腸癌不同臨床特征的相關(guān)性

45例患者的結(jié)腸癌組織中：miR-126表達在年齡、性別、分化程度、腫瘤大小間差異不顯著（P> 0.05），不具有統(tǒng)計學(xué)意義；miR-126表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期、臨床分期具有顯著的相關(guān)性，且miR-126表達水平在各個層之間差異顯著（P< 0.05），詳見表2。

三、miR-126抑制序列對HCT116細胞中miR-126表達的抑制效果

分別用miR-126抑制序列及對照序列轉(zhuǎn)染HCT116細胞，通過RT-PCR檢測兩株細胞中miR-126的相對表達量，結(jié)果顯示miR-126抑制序列成功的抑制了HCT116細胞中miR-126的表達水平，明顯低于正常HCT116細胞（P<0.01），而miR-126對照細胞中miR-126的表達水平與正常HCT116細胞沒有明顯差異，結(jié)果見表3。

表1 不同結(jié)腸組織的miR-126陽性表達情況[n（%）]

表2 miR-126表達與結(jié)腸癌不同臨床特征的相關(guān)性（n）

表3 兩種轉(zhuǎn)染細胞中的miR-126的表達量（x±s）

四、不同濃度的奧沙利鉑培養(yǎng)基對結(jié)腸癌細胞活性的影響

對miR-126抑制和miR-126陰性對照組細胞采用奧沙利鉑培養(yǎng)基培養(yǎng)，結(jié)果在0、5、10、20 mg/L的奧沙利鉑培養(yǎng)基中，miR-126抑制組的癌細胞活性（吸光度值）均顯著高于miR-126對照組且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），詳見表4。

表4 不同濃度的奧沙利鉑培養(yǎng)基下結(jié)腸癌細胞的吸光度值（x±s）

討論

結(jié)腸癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，起源于結(jié)腸黏膜上皮，目前尚無有效的治療方法，臨床上主要以手術(shù)切除、放化療及生物治療，因其易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和化療藥物耐藥，致使死亡率逐年升高，了解結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移及耐藥的機制對于患者的治療具有重要的作用。但因其機制復(fù)雜，涉及到很多癌基因及抑癌基因的表達異常，miRNA表達異常也是其中的重要環(huán)節(jié)。MicroRNA（miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約為19～25 nt的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，它通過與靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)完全或不完全互補調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因的表達，從而影響細胞的分化、增殖、凋亡和機體發(fā)育等過程，類似具有癌基因和抑癌基因的功能。

miRNA-126是近年來研究比較熱的小RNA分子，其定位于9q34.3（EGFL7基因第7個內(nèi)含子中），發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，屬于抑癌基因的范疇，其表達異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4]。很多研究顯示在乳腺癌、淋巴癌、宮頸癌[5]、胃癌等腫瘤組織中miRNA-126的表達水平明顯降低，如果恢復(fù)癌組織中miRNA-126的表達水平，或者在癌細胞中過表達miRNA-126，可以抑制腫瘤的生長、遷移和體內(nèi)的成瘤能力[6]。但是miRNA-126并不是在所有的腫瘤中都呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，有研究顯示miRNA-126在急性巨核細胞白血病細胞[7]、急性髓性白血病細胞、食管腺癌等癌組織呈現(xiàn)高表達。在本研究中擬對65例結(jié)腸癌患者的miRNA-126表達進行檢測，確定其在腫瘤發(fā)生中的作用，結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織的miR-126陽性表達率顯著低于癌旁組織、正常組織，說明miR-126的表達降低參與了結(jié)腸癌的發(fā)生，同時為了進一步證實miR-126在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)張中的作用，本研究對65例患者的年齡、性別、是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤大小等情況與miR-126表達情況進行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示miR-126表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期、臨床分期具有顯著的相關(guān)性，miR-126陰性的患者出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的幾率較大，而且臨床分期Ⅲ+Ⅳ期的患者比例比較大，提示miR-126低表達參與了腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，加速病情惡化，與結(jié)腸癌患者的病情的發(fā)展密切相關(guān)，與文獻報道一致[8]。

為了進一步研究miR-126對結(jié)腸癌耐化療藥物的影響，本研究中人工合成了沉默miR-126的短序列和對照序列，以HCT116細胞作為研究對象，通過轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建了低表達miR-126的HCT116的細胞和正常表達miR-126對照細胞，給予不同濃度的奧沙利鉑藥物，然后檢測兩種不同細胞的增殖狀態(tài)，結(jié)果顯示miR-126抑制組的癌細胞活性（吸光度值）均顯著高于miR-126對照組，說明抑制miR-126的表達降低了細胞對化療藥物的敏感性，是造成腫瘤耐藥的可能因素[9]。因此在結(jié)腸癌患者的化療過程中，采用可以恢復(fù)miR-126表達的藥物可以提高治療效果[10]。

在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中miR-126低表達可能通過三種機制參與，一是作用于腫瘤本身，促進腫瘤生長；二是促進腫瘤轉(zhuǎn)移；三是降低腫瘤細胞對于化療藥物的敏感性，從而降低治療的效果。因此在結(jié)腸癌的治療過程中，要加強對患者miR-126的篩查，防止癌細胞轉(zhuǎn)移，對于確診為結(jié)腸癌的患者，檢測miR-126的表達水平，指導(dǎo)臨床用藥和預(yù)后判斷，具有重要意義。

1李楠,李夏雨,黃鑠,等.miR-126靶向調(diào)控IRS1，SLC7A5及TOM1基因抑制結(jié)腸癌的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移.中南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版),2013,38(8):809-816.

2鄭志偉,勞海燕,余細勇,等.冠心病患者血漿循環(huán)miR-126的表達及其對血管內(nèi)皮細胞的影響.中國病理生理雜志,2011,27(12): 2313-2317.

3蔡惠,王健生,張明鑫,等.hsa-miR-126和hsa-miR-518b在食管鱗癌中的表達.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2011,31(1):23-27.

4Feng R,Chen X,Yu Y,et al.miR-126 functions as a tumour suppressorin human gastric cancer.Cancer Lett,2010,298(1):50-63.

5劉琳,王月玲,王江芬.miR-21、miR-126、miR-143和miR-373在正常宮頸組織、宮頸癌組織及Hela細胞中的表達差異.四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2012,43(4):536-539.

6Png KJ,Halberg N,Yoshida M,et al.A microRNA regulon thatmediates endothelial recruitment and metastasis by cancer cells.Nature,2011,481(7380):190-194.

7Li ZJ,Lu J,Sun M,et a1.Distinct microRNA expression profiles in acute myeloid leukemia with common translocations.Proc Natl A－cad Sci USA,2008,105(40):l5535-l5540.

8林孟波,王金泗,薛芳沁,等.miR-126在人結(jié)腸癌細胞中的表達及其對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為的影響.疑難病雜志,2014,13(4): 395-398.

9Liu B,Peng XC,Zheng XL,et a1.MiR-126 restoration downregulate VEGF and inhibit the growth of lung cancer cell lines invitro and in vivo.Lung Cancer,2009,66(2):169-175.

10 Miko E,Margtai Z,Czimmerer Z,et al.miR-126 inhibits proliferationof small cell lung cancer cells by targeting SLC7A5.FEBS Lett, 2011,585(8):1191-1196.

Expression of miR-126 in human colon cancer cells and its effect on drug resistance

WANG Xiao-shan1, ZHANG Zhan-xue2,LIN Lin2,LI Tao2,QIU Shao-fan2,ZHANG Hai-qiang2,SONG Wei-qing2.1)Department of General Surgery,People′s Hospital of Weixian County,Xingtai,Hebei Province,054700;2)Department of Gastrointestinal Surgery,Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei Province,050000

Objective To investigate the expression of miR-126 in human colon cancer cells and its effect on drug resistance.Methods Forty five cases of colon cancer tissues,para-carcinoma tissues and 30 cases of normal colon tissues were collected from July 2010 to August 2013 in Department of Oncology of our hospital.By detecting miR-126 expression levels using fluorescent PCR,culturing HCT116 cells in vitro,suppressing the expression of miR-126 by transfecting the suppressing sequence,we studied the drug resistance effect of miR-126 in HCT116 cells.Results The positive rate of miR-126 expression in colon cancer tissues was significantly lower than that in para-carcinoma tissues and normal tissues(P<0.05);moreover,this rate in para-carcinoma tissues was also lower than that in normal tissues,but the difference was not significant(P> 0.05).No significant differences of miR-126 expression in age,gender,differentiation，and,tumor size were observed(P>0.05),but miR-126 expression was found to be associated with lymph node metastasis,Dukes′staging and clinical staging;the differences among miR-126 expression levels was also significant(P<0.05). In 0,5,10,20 mg/L oxaliplatin medium,cancer cell activity(absorbance)in miR-126 positive group was significantly lower than in miR-126 negative group(P<0.05).Conclusion The positive expression of miR-126 in colon cancer tissues is relatively low,whereas this positive expression can reduce drug resistance of cancer cells and is beneficial to the treatment of colon cancer.

MiR-126;Colon cancer;Metastasis;Drug resistance;Proliferation ability結(jié)腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，死亡率很高，大約能達到新發(fā)病人數(shù)的50%，嚴(yán)重威脅患者的健康和生命。目前對于結(jié)腸癌的治療效果還不是很理想，早期手術(shù)預(yù)后較好，但是晚期患者的5年生存率僅達到20%左右，死亡的原因大多是腫瘤轉(zhuǎn)移，因此了解結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素對于治療具有一定的指導(dǎo)作用[1]。miRNA是長約20～22個核苷酸的微小非編碼RNA，在細胞的分化、凋亡、增殖、遷移等生物學(xué)過程中發(fā)揮了重要作用，而且有研究顯示其具有類似癌基因與抑癌基因的功能，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色[2]。在本研究中，通過檢測miR-126在人結(jié)腸癌細胞中的表達并分析對結(jié)腸癌細胞耐藥性的影響，從而闡明miR-126在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展的作用，為結(jié)腸癌的臨床治療提供依據(jù)。

2014-07-09）

（本文編輯：龔偉）

10.3961/j.issn.1672-2159.2014.04.005

1 054700邢臺市威縣人民醫(yī)院普外科；

2 050000河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院胃腸外科

張占學(xué)，E-mail：13363858865@189.cn