遲鑫明 胡 軍 張麗媛 趙皓琦 郝立宏

（大連醫(yī)科大學(xué)，1遼寧省高校蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2組織胚胎學(xué)教研室，大連116044）

果糖二磷酸醛縮酶A（Fructose－bisphosphate aldolase A，aldolase A，ALDOA）是一種糖酵解酶，同時(shí)也是ATP合成所必需的酶。ALDOA存在于紅細(xì)胞和骨骼肌中，與肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合從而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲束的形成。ALDOA在糖酵解過(guò)程中，主要通過(guò)使C3、C4間的鍵斷裂而導(dǎo)致己糖磷酸果糖－1，6－二磷酸分解形成3－磷酸甘油醛和磷酸二氫丙酮。以往對(duì)ALDOA的研究主要著重于其參與糖酵解過(guò)程和細(xì)胞形態(tài)維持以及與自身免疫性疾病發(fā)生相關(guān)方面。隨著研究不斷的深入，越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示糖代謝異常在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，與糖代謝相關(guān)的糖酵解酶與腫瘤之間的關(guān)系也逐漸成為研究熱點(diǎn)之一［1］。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)ALDOA在肝癌及胰腺癌組織芯片中的表達(dá)，探討其在癌組織中表達(dá)的意義，為后期進(jìn)一步研究其在腫瘤中的作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1．材料

1．1試劑

PV－9000兩步法試劑盒、檸檬酸鹽緩沖液、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人ALDOA多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1．2組織芯片

組織芯片包含30例肝癌組織及6例對(duì)照（肝臟正常組織）；30例胰腺癌組織及6例對(duì)照（胰腺正常組織）。其中肝癌患者男性26例，女性4例，年齡38－70歲，平均55歲。按照分化程度將病例分為三組，其中高分化組患者4例，中分化患者19例，低分化患者7例。胰腺癌患者男性18例，女性12例，年齡43－74歲，平均60歲。高分化患者6例，中分化患者21例，低分化患者3例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者20例。

2．免疫組織化學(xué)染色

將組織石蠟切片置于60℃烤箱中烤45min，常規(guī)脫蠟至水，然后用蒸餾水洗片。將切片置于濕盒中，室溫下用3%H2O2孵育10min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗片。將切片置于0．01mol／L、pH6．0的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中，置于微波爐中用高火加熱5min，關(guān)火放置5min；中火加熱5min，關(guān)火放置5min；再中火加熱5min，關(guān)火放置5min。涼至室溫后PBS洗片。血清封閉20min。加入Ⅰ抗（1∶100稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜。次日37℃溫育45min，PBS洗片。滴加PV9000－Ⅱ抗－1，濕盒中室溫放置20min，PBS洗片。滴加PV9000－Ⅱ抗－2，同上。加入適量新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察顯色。蒸餾水洗片。蘇木素復(fù)染8min，蒸餾水洗片。鹽酸乙醇10s，蒸餾水洗片，氨水返藍(lán)15s，洗片。最后，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并攝片，SPSS統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

3．結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：①細(xì)胞中的染色強(qiáng)度評(píng)分：0分（陰性）、1分（淺黃色顆粒）、2分（棕黃色顆粒）、3分（棕黑色顆粒）。②陽(yáng)性細(xì)胞所占細(xì)胞數(shù)量的百分率計(jì)分：0分（陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤25%）、1分（26%≤陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤50%）、2分（51%≤陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤75%）、3分（76%≤陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤100%）。

每塊組織蛋白表達(dá)強(qiáng)度的總評(píng)分＝染色強(qiáng)度的分?jǐn)?shù)＋陽(yáng)性細(xì)胞百分率的分?jǐn)?shù)，0－2分即為陰性（－）、3－4分為陽(yáng)性（＋）、5－6分為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋）。陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性的總和計(jì)算陽(yáng)性率。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩個(gè)樣本之間的臨床病理參數(shù)分析采用χ2檢驗(yàn)，所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0．05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．01被認(rèn)為差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．ALDOA在肝癌組織中的表達(dá)情況

ALDOA大部分定位在細(xì)胞質(zhì)中，少量定位在細(xì)胞核中。ALDOA在肝癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為80%（24／30），在正常肝組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為33．3%（2／6）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ALDOA在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于正常肝組織，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）（圖1－1，表1）。

表1 ALDOA在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)Table 1 The expression of ALDOA in liver cancer tissues and the normal control

2．ALDOA的表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

我們將30例肝癌患者臨床病例資料中的各項(xiàng)指標(biāo)與ALDOA的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示見(jiàn)表2，ALDOA的表達(dá)與性別、年齡、分化程度均無(wú)相關(guān)性（P＞0．05）。

表2 肝癌組織中ALDOA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 2 The relationship between expression of ALDOA in liver cancer tissues and clinical pathologic features

3．ALDOA在胰腺癌組織中的表達(dá)情況

ALDOA在胰腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為為66．7%（20／30），在正常胰腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為0%（0／6），ALDOA在胰腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于正常胰腺組織，二者差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）（圖2，表3）。

表3 ALDOA在胰腺癌組織和正常組織中的表達(dá)Table 3 The expression of ALDOA in pancreatic cancer tissues and the normal control

4．ALDOA的表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

我們將30例胰腺癌患者臨床病例資料中的各項(xiàng)指標(biāo)與ALDOA的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示ALDOA的表達(dá)與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度均無(wú)相關(guān)性（P＞0．05）（表4）。

表4 胰腺癌組織中ALDOA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 4 The relationship between expression of ALDOA in pancreatic cancer tissues and clinical pathologic features

討 論

肝癌和胰腺癌同屬于消化腺腫瘤，惡性程度很高。全世界每年有100萬(wàn)肝癌新發(fā)病例，而每年因肝癌死亡至少有50萬(wàn)人。肝癌發(fā)展迅速，若治療不及時(shí)或治療方案選擇不當(dāng)，平均生存時(shí)間為半年。胰腺癌診斷和治療都很困難，5年生存率＜5%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。因此，臨床上早期明確診斷肝癌、胰腺癌是獲治的關(guān)鍵［2，3］。

有研究表明，高表達(dá)ALDOA可加速糖酵解的進(jìn)程，其在細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)與增殖相關(guān)，ALDOA表達(dá)下調(diào)可引起糖酵解異常，使細(xì)胞內(nèi)ATP減少，使細(xì)胞膜缺損，ALDOA異常表達(dá)還與許多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展等相關(guān)［4，5］。Du S等研究發(fā)現(xiàn)，ALDOA在肺鱗癌組織中高表達(dá)，并與肺鱗癌轉(zhuǎn)移、分期、分化程度及預(yù)后差相關(guān)，是潛在的肺鱗癌轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)記物［6］。Chen X等經(jīng)過(guò)綜合蛋白質(zhì)組學(xué)各方面的數(shù)據(jù)分析并驗(yàn)證，認(rèn)為ALDOA在骨肉瘤中高表達(dá)與患者生存時(shí)間短密切相關(guān)，可做為臨床預(yù)后判斷的指標(biāo)［7］。Long F等研究發(fā)現(xiàn)，ALDOA在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)后，可以增高M(jìn)MP－2表達(dá)，因而促進(jìn)細(xì)胞侵襲能力，并抵抗順鉑誘導(dǎo)的凋亡；裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明ALDOA高表達(dá)后，移植瘤體積增大，可促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移，原發(fā)瘤中細(xì)胞凋亡減少［8］。Caspi M 等研究認(rèn)為，ALDOA是新的 Wnt信號(hào)通路調(diào)控者，可以GSK－3β依賴(lài)的機(jī)制激活經(jīng)典的 Wnt信號(hào)通路，而Wnt信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［9］。

本實(shí)驗(yàn)我們應(yīng)用組織芯片檢測(cè)ALDOA在肝癌及胰腺癌組織及正常組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示：ALDOA主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。ALDOA在肝癌、胰腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示高表達(dá)的ALDOA可能與肝癌、胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，尚有待更深入的實(shí)驗(yàn)研究。但是，實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到ALDOA與肝癌、胰腺癌患者的性別、年齡、分化程度有關(guān)，也未檢測(cè)到與胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。下一步，我們將擴(kuò)大樣本，并增加正常對(duì)照組織的樣本量，進(jìn)一步探討ALDOA高表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，如能明確ALDOA在肝癌、胰腺癌等腫瘤發(fā)生及進(jìn)展中的作用，將有助于認(rèn)識(shí)肝癌及胰腺癌發(fā)生的分子機(jī)制，并可能成為臨床檢測(cè)的重要腫瘤標(biāo)志物，起到預(yù)警作用，從而實(shí)現(xiàn)其臨床價(jià)值。

圖 版 說(shuō) 明

圖1 ALDOA的表達(dá) ×200 A：肝癌組織；B：正常肝組織

圖2 ALDOA的表達(dá) ×200 A：胰腺癌癌組織；B：正常胰腺組織

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1The expression of ALDOA ×200 A：liver cancer tissue；B：normal liver tissue

Fig．2The expression of ALDOA ×200 A：pancreatic cancer tissue；B：normal pancreatic tissue

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［3］Lee ES，Lee JM．Imaging diagnosis of pancreatic cancer：a state－of－the－art review．World J Gastroenterol，2014，20（24）：7864－7877

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［9］Caspi M，Perry G，Skalka N，et al．Aldolase positively regulates of the canonical Wnt signaling pathway．Mol Cancer，2014，13：164